魏海萍，郭佳，王歡，葛朝明

蘭州大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，甘肅蘭州市 730030

腦卒中嚴(yán)重危害中老年人健康，但缺乏有效干預(yù)措施[1]。缺血半影區(qū)神經(jīng)元自噬是缺血性腦卒中發(fā)生、發(fā)展的重要病理生理機(jī)制[2]。腦缺血發(fā)生時(shí)存在自噬[3]，自噬可減輕缺血性腦卒中神經(jīng)損傷[4]，在腦缺血中發(fā)揮腦保護(hù)作用[5]，也可加重腦缺血損傷[6]。迷走神經(jīng)刺激(vagus nerve stimulation,VNS)已被廣泛應(yīng)用于治療各種疾病[7]，如改善抑郁小鼠癥狀[8]、癲癇、頭痛和阿爾茨海默病等[9-11]，姜黃素聯(lián)合VNS 可減輕腦缺血再灌注損傷引起的行為障礙[12]。

調(diào)控腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK)信號(hào)通路的自噬可改善認(rèn)知障礙[13]。硒代蛋氨酸通過AMPK 激活下游哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)，從而激活皮層神經(jīng)元自噬，改善阿爾茨海默病小鼠認(rèn)知功能[14]。AMPK 激活需要α 亞基蘇氨酸(Threonine)172 位點(diǎn)磷酸化，通過活化AMPK/mTOR/Unc-51 樣自噬活化激酶信號(hào)通路可激活自噬[15]。

沉默信息調(diào)節(jié)因子2 相關(guān)酶1 (silent mating type information regulation 2 homolog 1,Sirt1)是一種重要的去乙酰化酶，在神經(jīng)退行性疾病中保護(hù)神經(jīng)元[16]。Sirt1 能與微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3 (microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)相互作用，在自噬泡形成階段起重要作用。Sirt1 的活化可正向調(diào)節(jié)AMPK，AMPK-Sirt1通路與認(rèn)知障礙有關(guān)[17]。

本研究探討VNS在缺血性腦卒中大鼠缺血半影區(qū)細(xì)胞自噬中的作用及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及造模

成年雄性SPF 級(jí)Sprague-Dawley 大鼠56 只，由蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，分為正常組(n=14)、假手術(shù)組(n=14)、模型組(n=14)和VNS 組(n=14)。后兩組參照文獻(xiàn)[18-19]線栓法阻斷大腦中動(dòng)脈(middle cerebral artery occlusion,MCAO) 1 h 再 灌 注。VNS 組 在 血流阻斷0.5 h 時(shí)，行左側(cè)VNS(因左側(cè)迷走神經(jīng)發(fā)出支配心臟纖維少)，實(shí)驗(yàn)參數(shù)和操作參照文獻(xiàn)[20]。再灌注24 h后，行以下測(cè)試。

所有操作遵循動(dòng)物福利與倫理原則。

1.2 Longa評(píng)分和TTC染色

各組取5 只，采用Longa 評(píng)分法[18]行神經(jīng)缺損程度評(píng)估。

各組取4 只斷頭取腦，切5 片，TTC(美國(guó)SIGMA公司)染色，Image-pro plus軟件計(jì)算梗死體積。

1.3 Western blotting

各組取5 只大鼠腦缺血半影區(qū)腦組織，制備蛋白樣品，并進(jìn)行凝膠電泳(上海江美生物科技有限公司)、轉(zhuǎn)膜，牛奶封閉，加抗Beclin-1、β-actin (PROTEINTECH 公司)、LC3、AMPK、P-AMPK(Thr172)、Sirt1(CST 公司)一抗體孵育，發(fā)光顯影曝光目的蛋白。stern blotting其他試劑由SIGMA公司提供。計(jì)算各條帶與正常組的光密度百分比。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果以()表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LDS檢驗(yàn)。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 腦梗死體積

模型組和VNS 組明顯出現(xiàn)白色梗死區(qū)(圖1)，與模型組相比，VNS組梗死區(qū)體積顯著減少(P＜0.001)。見表1。

2.2 Longa評(píng)分

與假手術(shù)組相比，模型組和VNS 組Longa 評(píng)分明顯升高(P＜0.01)。與模型組相比，VNS 組大鼠Longa評(píng)分下降(P＜0.05)。見表2。

2.3 Western blotting

與假手術(shù)組相比，模型組和VNS 組Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-I比、P-AMPK(Thr172)和Sirt1 蛋白表達(dá)顯著下降(P＜0.001)。與模型組相比，VNS 組Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-I比、P-AMPK(Thr172)和Sirt1 蛋白表達(dá)顯著升高(P＜0.001)。見圖2、表3。

圖1 各組腦梗死體積(TTT染色)

表1 各組腦梗死體積(%)

表2 各組大鼠Longa評(píng)分比較

圖2 各組腦缺血半影區(qū)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)(Western blotting)

表3 各組腦缺血半影區(qū)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)(%)

3 討論

減輕腦缺血后神經(jīng)元損傷可改善缺血性腦卒中的預(yù)后[19]。本研究顯示，VNS 能減少大鼠腦梗死體積，減輕神經(jīng)功能缺損，與以前報(bào)道VNS能減輕腦缺血損傷相符[20]。本研究還顯示，腦缺血后，半影區(qū)自噬水平下降，而VNS 能使自噬水平回升，可能與AMPK磷酸化水平和Sirt1蛋白水平回升有關(guān)。

在缺血性腦卒中復(fù)雜的缺血再灌注損傷過程中，自噬是一個(gè)連續(xù)更新的生理過程。自噬有雙刃劍作用[21]。自噬調(diào)控大多數(shù)在自噬誘導(dǎo)階段，其中AMPK通過調(diào)控mTOR 對(duì)自噬進(jìn)行調(diào)節(jié)和反饋[22]。AktmTOR 通路屬于經(jīng)典通路，激活A(yù)kt-mTOR 通路調(diào)節(jié)自噬水平，可實(shí)現(xiàn)腦保護(hù)作用[23]。Sirt1 是AMPK 下游靶蛋白[24]。VNS 通過激活A(yù)MPK-Sirt1 通路活化自噬，減少神經(jīng)病理演變進(jìn)程，改善由于急速血流阻斷引起的神經(jīng)細(xì)胞壞死，發(fā)揮腦保護(hù)作用。然而，過度自噬將加重腦損傷[25]。VNS 通過激活自噬減輕腦缺血損傷的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，VNS 可能通過調(diào)節(jié)AMPK-Sirt1 自噬通路，減輕大鼠缺血性腦損傷。但自噬是把雙刃劍，何種水平自噬有利于神經(jīng)保護(hù)、VNS的具體參數(shù)與自噬水平的相關(guān)性、VNS 的介入時(shí)機(jī)等，尚需進(jìn)一步研究。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。