喬改霞，王榮，劉玉娟，曾繼娟，徐美隆1,，謝軍1,，范培格*

（1. 中國(guó)科學(xué)院植物研究所，北京 100093；2. 寧夏林業(yè)研究院/種苗生物工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏銀川 750004；3. 寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750021；4. 中國(guó)葡萄酒產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，寧夏銀川 750021）

抗性育種中抗病育種是人們一直追求的育種目標(biāo)，尤其是在歐洲和美洲國(guó)家。霜霉病是世界上最嚴(yán)重的真菌病害之一，而白粉病幾乎存在于所有的釀酒葡萄產(chǎn)區(qū)[1]。黃宏娟[2]研究表明，感染白粉病的葡萄釀制的酒具有苦味和其他不良風(fēng)味；而霜霉病會(huì)導(dǎo)致葉片光合性能下降，嚴(yán)重的會(huì)造成早期落葉，從而使葡萄營(yíng)養(yǎng)不足，降低葡萄果實(shí)的成熟度[3-4]。美洲種葡萄是抗病性較強(qiáng)的種質(zhì)資源，能抗多種真菌病，同時(shí)也具有較強(qiáng)的抗寒性能，但其具有的濃烈狐香味，以及青草味等，釀出的酒不易被接受[5-6]。山葡萄能耐-40 ℃低溫，是葡萄屬中最抗寒的種，對(duì)白粉病、白腐病等真菌病害抗性強(qiáng)，但不抗霜霉病[7]。歐亞種葡萄雖然具有較好的果實(shí)品質(zhì)特性，但抗寒性及抗病性較差[8-9]。

寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)是我國(guó)集中連片面積最大的葡萄酒產(chǎn)區(qū)，但當(dāng)?shù)貥O端的大陸性季風(fēng)氣候條件下，休眠季干旱寒冷，生長(zhǎng)季雨熱同季，導(dǎo)致歐亞種釀造品種冬季需要埋土防寒，夏季需要噴施大量化學(xué)農(nóng)藥，已成為阻礙葡萄與葡萄酒產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要瓶頸。因此，選育、種植抗逆的適宜品種是解決這一瓶頸問題的最有效途徑。抗寒旱品種選育一直是我國(guó)釀酒葡萄選育的重要方向，利用抗寒性極強(qiáng)的山葡萄為親本已選育出了一些優(yōu)良品種，如‘北紅’‘北玫’等歐山雜種。但這些品種在雨熱同季的氣候條件下也會(huì)感染霜霉病等病害。如何在選育抗寒旱新品種的同時(shí)，引入抗病基因是當(dāng)前我國(guó)抗逆育種需要解決的問題。

本研究以含山葡萄血統(tǒng)的歐山雜種與含有河岸葡萄（V. riparia）、美洲葡萄（V. labrusca）、歐亞種葡萄（V. vinifera）血統(tǒng)的雜種后代進(jìn)行雜交獲得的多種群雜交群體后代典型株系為材料，分別以歐山雜種‘北玫’（V. vinifera×V. amurensis）、‘北紅’（V. vinifera×V.amurensis），歐美雜種‘威代爾’（V. vinifera×V.labrusca），歐亞種‘貴人香’（V. vinifera）為對(duì)照，進(jìn)行抗病性研究，旨在根據(jù)其抗病特點(diǎn)，提出育種方向及親本選擇的可行性，為抗病育種提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料：中科院西北生物中心平吉堡基地露地越冬的4年生含山葡萄、河岸葡萄、美洲葡萄、歐亞種葡萄血統(tǒng)的多種群雜交后代05-1群體，它們是以‘北紅’為母本，‘7-11-49’[（Minnesota 78（Beta×Witt）×V.riparia）×V. vinifera]為父本雜交而來。同地塊的2個(gè)歐山雜種‘北玫’‘北紅’以及1個(gè)歐美雜種‘威代爾’和1個(gè)歐亞品種‘貴人香’為對(duì)照，共計(jì)20個(gè)種質(zhì)。

1.2 種植情況

試材采用‘廠’字形樹形，行距3.0 m，株距1.0 m。栽培管理一致。冬季不埋土。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 霜霉病鑒定

（1）田間自然鑒定。于2019年8月在葡萄霜霉病發(fā)生穩(wěn)定期對(duì)各種質(zhì)葡萄霜霉病發(fā)生情況進(jìn)行調(diào)查，選取枝條頂端第5～14片共10片葉進(jìn)行觀測(cè)。每個(gè)種質(zhì)調(diào)查10個(gè)枝條，共100片葉。

霜霉病病情調(diào)查采用Desaymard分級(jí)法[10]：

根據(jù)葉片病斑面積占全葉面積百分率（R）劃分病級(jí)：0級(jí)：全葉無病斑R＝0；1級(jí)：0＜R≤5%；2級(jí)：5%＜R≤25%；3級(jí)：25%＜R≤50%；4級(jí)：50%＜R≤75%；5級(jí)：R＞75%或葉片枯死。

（2）室內(nèi)接種鑒定。采集新鮮葡萄葉片，用無菌水沖洗掉表面的灰塵，將病菌配成濃度為1×105個(gè)/毫升的孢子囊懸浮液，噴霧接種到感病葡萄離體葉片背面進(jìn)行繁殖，葉柄用潤(rùn)濕脫脂棉包裹保濕，置于底部墊有瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，封口保濕。22～28 ℃培養(yǎng)4～7 d，收集新鮮病原菌用于抗病性評(píng)價(jià)。

采集每個(gè)葡萄種質(zhì)枝條頂端第4～6節(jié)位的健康新鮮葉片，用自來水沖洗干凈，并吸干水分，再用75%的酒精滅菌20 s，1%的次氯酸鈉溶液滅菌5～7 min，無菌水沖洗3次后，用直徑為1 cm的打孔器在葉片背面畫圈，每個(gè)重復(fù)5片葉，葉背朝上放入有瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，噴霧接種濃度為1×105個(gè)/毫升的孢子囊懸浮液，在密封保濕、25～28 ℃、每天光照12 h條件下培養(yǎng)。接種7 d后調(diào)查發(fā)病情況。每個(gè)處理采樣15片葉。

1.3.2 白粉病鑒定

于2019年9月在葡萄白粉病發(fā)生穩(wěn)定期對(duì)各種質(zhì)葡萄白粉病發(fā)生情況進(jìn)行調(diào)查，葉片選樣、分級(jí)及計(jì)算方法與霜霉病田間調(diào)查方法相同。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2017軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析；SPSS 21.0軟件進(jìn)行方差分析和聚類分析，Origin輔助作圖。

根據(jù)以下公式計(jì)算病情指數(shù)，通過病情指數(shù)分析不同葡萄品種對(duì)霜霉病及白粉的抗感病情況。

病情指數(shù)＝∑（感病極值×該級(jí)發(fā)病葉數(shù)）/（調(diào)查總?cè)~片數(shù)×最高感病級(jí)別）×100

品種反應(yīng)型按照國(guó)際植物種質(zhì)委員會(huì)（IBPGR）的標(biāo)準(zhǔn)將其分為5級(jí)[11]：免疫（I）：病情指數(shù)：0；高抗（HR）：病情指數(shù)≤5；抗?。≧）：5＜病情指數(shù)≤25；感病（S）：25＜病情指數(shù)≤50；高感（HS）：50＜病情指數(shù)≤100。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同葡萄種質(zhì)田間霜霉病鑒定

田間調(diào)查結(jié)果表明（表1），供試的20個(gè)葡萄種質(zhì)的葉片發(fā)病率差異較大，‘貴人香’葉片發(fā)病率最高，95%的葉片感染霜霉病，其次是‘05-2-12’，有89%的葉片感染霜霉病，‘05-1-144’發(fā)病率最低，僅有2%的葉片感染。病情指數(shù)反映種質(zhì)間感病性的差異，根據(jù)霜霉病病情指數(shù)將供試種質(zhì)大致分為4類：‘貴人香’的病情指數(shù)為66.03，屬于高感品種；‘05-2-12’病情指數(shù)為45.53，屬于感病類；‘05-1-17’‘05-1-133’‘北紅’‘北玫’‘威代爾’等10個(gè)種質(zhì)病情指數(shù)在5～25，屬于抗病類；‘05-1-444’‘05-1-247’‘05-1-220’等8個(gè)優(yōu)系病情指數(shù)小于5，屬于高抗類。

2.2 不同葡萄種質(zhì)室內(nèi)接種霜霉病鑒定結(jié)果

通過20個(gè)葡萄種質(zhì)的室內(nèi)霜霉病抗性鑒定（表2）結(jié)果表明，各種質(zhì)接種后對(duì)霜霉病的抗逆性存在明顯差異?！?5-1-247’抗性最強(qiáng)，‘05-1-444’次之，屬于高抗品系?！?5-1-323’‘05-1-133’等9個(gè)優(yōu)系病情指數(shù)在5～25，屬于抗性類別；‘05-1-76’‘北紅’‘北玫’‘威代爾’‘貴人香’等9個(gè)種質(zhì)，病情指數(shù)在25～50，屬于感病類別。方差分析結(jié)果表明：‘05-1-247’與‘05-1-444’2個(gè)優(yōu)系之間無顯著差異，抗性較強(qiáng)；‘貴人香’‘北紅’‘北玫’‘威代爾’等8個(gè)種質(zhì)之間存在顯著差異，且‘05-1-586’‘貴人香’與其它18個(gè)種質(zhì)之間也存在顯著差異，抗性最弱。

2.3 不同葡萄種質(zhì)田間白粉病鑒定

田間白粉病鑒定結(jié)果（表3）表明，供試的20個(gè)葡萄種質(zhì)田間白粉病的發(fā)病率和病情指數(shù)差異顯著，尤其是群體優(yōu)系的抗性表現(xiàn)從免疫到感病出現(xiàn)了極大的分離?！?5-1-76’‘北玫’‘威代爾’等7個(gè)種質(zhì)田間無白粉病發(fā)病，對(duì)白粉病為免疫級(jí)別；‘貴人香’‘北紅’‘05-1-155’等9個(gè)種質(zhì)，病情指數(shù)小于5，屬于高抗品種；‘05-1-12’病情指數(shù)為11.37，屬于抗性類別；而‘05-1-87’‘05-1-220’‘05-1-323’3個(gè)優(yōu)系，病情指數(shù)在25～50，屬于感病類別。免疫優(yōu)系‘05-1-76’發(fā)病率為0，而感病優(yōu)系‘05-1-323’發(fā)病率高達(dá)74%，優(yōu)系間對(duì)白粉病的抗性差異較大。

2.4 不同葡萄種質(zhì)對(duì)霜霉病田間和室內(nèi)接種抗性反應(yīng)的聚類分析

根據(jù)20個(gè)葡萄種質(zhì)對(duì)田間霜霉病的抗性反應(yīng)進(jìn)行了聚類分析。結(jié)果如圖1所示，當(dāng)歐式距離系數(shù)為15時(shí)，不同葡萄種質(zhì)對(duì)霜霉病田間抗病性可劃分為4類。第一類：抗性較強(qiáng)，包括‘05-1-444’‘05-1-247’等13個(gè)種質(zhì)，病情指數(shù)為0.40～10.04；第二類：抗性中等，包括‘威代爾’‘05-1-323’‘05-1-62’‘北紅’‘05-1-87’共5個(gè)種質(zhì)，病情指數(shù)為12.43～24.60；第三類：感病類別，只有‘05-2-12’，病情指數(shù)達(dá)45.53；第四類：高感病類別，‘貴人香’病情指數(shù)高達(dá)66.03。

同時(shí)，對(duì)霜霉病室內(nèi)的抗性結(jié)果進(jìn)行了聚類分析。結(jié)果表明，當(dāng)歐式距離系數(shù)為12時(shí)，可以將20個(gè)種質(zhì)劃分為4類（圖2）。第一類抗性較強(qiáng)，病情指數(shù)在1.33～12.88，如‘05-1-247’‘05-1-17’等9個(gè)種質(zhì)；第二類抗性中等，病情指數(shù)為19.6～21，如‘05-1-155’‘05-1-133’；第三類表現(xiàn)感病，病情指數(shù)為28.12～34.98，包括‘05-1-87’‘05-1-62’等7個(gè)種質(zhì)；第四類為感病較強(qiáng)，病情指為42，如‘05-1-586’和‘貴人香’2個(gè)種質(zhì)。

表2 不同葡萄種質(zhì)室內(nèi)接種霜霉病調(diào)查情況Table 2 Investigation of downy mildew in different grape germplasms

2.5 不同種質(zhì)對(duì)白粉病田間抗性反應(yīng)的聚類分析

根據(jù)20個(gè)葡萄種質(zhì)對(duì)田間白粉病的抗性反應(yīng)進(jìn)行了聚類分析（圖3）。當(dāng)歐式距離系數(shù)為10時(shí)，可將20個(gè)種質(zhì)分為4類。第一類抗性較強(qiáng)，包含‘05-1-76’‘北玫’‘威代爾’等7個(gè)免疫種質(zhì)，病情指數(shù)為0，也包含‘貴人香’‘北紅’‘05-1-155’等9個(gè)種質(zhì)，病情指數(shù)均小于3.57，均為抗性較強(qiáng)種質(zhì)。第二類抗病中等，只有‘05-1-12’，病情指數(shù)為11.37；第三類為感病種質(zhì)，有‘05-1-87’‘05-1-220’，病情指數(shù)為25～30；第四類為高感病種質(zhì)，只有‘05-1-323’，病情指數(shù)為48.8。

3 討論與結(jié)論

寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)是我國(guó)集中連片面積最大的葡萄酒產(chǎn)區(qū)，截止到2017年底，葡萄總面積達(dá)4.3萬 hm2，其中釀酒葡萄3.8萬 hm2[11]。由于賀蘭山東麓主要為大陸季風(fēng)性氣候，生長(zhǎng)季與雨季同季[12]，且主栽品種是‘赤霞珠’‘美樂’等歐亞種[8]，它們一般不抗霜霉病[13]，在大面積單一種植的同時(shí)，加劇了病蟲害的發(fā)生。目前，葡萄霜霉病和白粉病是賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)的主要病害，每年夏季的大面積爆發(fā)嚴(yán)重降低了葡萄的產(chǎn)量和品質(zhì)，使種植效益受到極大損失[14]。雖然利用更新栽培技術(shù)、生物防治等方法來預(yù)防葡萄病害，也取得了不錯(cuò)的效果，但是選擇和推廣抗病性強(qiáng)的品種才是保證產(chǎn)業(yè)得到可持續(xù)發(fā)展的有效手段[15]。

葡萄雜交育種是綜合利用親本的優(yōu)良基因培育新品種的基本方式。為了選育優(yōu)質(zhì)、抗旱寒或者抗病的新品種，雙親必須具有優(yōu)質(zhì)、抗旱寒或抗病的特性[16]。

表3 不同葡萄種質(zhì)田間白粉病調(diào)查Table 3 Investigation of powdery mildew of different grape germplasms in field

Boubals[17]系統(tǒng)地研究葡萄屬植物對(duì)白粉病的抗性，認(rèn)為北美種群中的美洲葡萄、河岸葡萄抗性最強(qiáng)；在17世紀(jì)時(shí)，美國(guó)育種專家利用抗寒抗病的美洲葡萄與歐洲品種雜交，先后獲得了抗逆性強(qiáng)的‘康克’‘卡托巴’等品種[18]；在19世紀(jì)時(shí)，法國(guó)育種家就利用抗病性較強(qiáng)的美洲種或美洲種與歐亞種葡萄雜交，育成了一批抗霜霉病和白粉病能力強(qiáng)，釀酒品質(zhì)與歐洲品種相當(dāng)?shù)男缕贩N，如‘Bronx’‘Castets’等[18]。通常，抗病的歐美第一、二代雜種具有強(qiáng)烈的狐臭味，所釀的葡萄酒不易被接受，現(xiàn)代育種家通過與歐洲種回交的方法，來提高其釀酒品質(zhì)。如美國(guó)紐約州農(nóng)業(yè)試驗(yàn)站培育成的新品種‘Cayuga White’‘Lakemont’等就具有較好的抗寒、抗病性能，且具有優(yōu)良的釀酒品質(zhì)[19]。山葡萄是葡萄屬抗寒性最強(qiáng)的種，20世紀(jì)初，中國(guó)育種家開始利用山葡萄作為抗寒育種的親本，選育出了多個(gè)抗逆性和品質(zhì)較好的品種，如‘北醇’‘北紅’‘北玫’等[16]。山葡萄沒有強(qiáng)烈的不良味道，有很好的釀酒特性，但山葡萄及其雜種抗病性，尤其是抗霜霉病的特性遠(yuǎn)不如美洲血統(tǒng)葡萄品種[7]。因此，引入抗病性較強(qiáng)的美洲血統(tǒng)葡萄雜種后代可豐富抗病基因，選育出既抗寒旱又抗病的新品種。

本研究結(jié)果也證明了這一點(diǎn)，16個(gè)多種群雜交后代優(yōu)系在田間自然條件下有15個(gè)優(yōu)系表現(xiàn)為抗霜霉病，室內(nèi)接種條件下有11個(gè)優(yōu)系屬于抗性類型，‘北紅’‘北玫’‘威代爾’田間表現(xiàn)抗病，但室內(nèi)接種表現(xiàn)感病，歐亞種‘貴人香’無論是田間自然條件還是室內(nèi)接種條件均表現(xiàn)不抗，而雜種優(yōu)系表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗霜霉病性能。對(duì)白粉病抗性方面，有5個(gè)優(yōu)系表現(xiàn)為免疫，7個(gè)表現(xiàn)為高抗，1個(gè)表現(xiàn)為抗?？梢哉f多數(shù)優(yōu)系表現(xiàn)出優(yōu)異的抗病性能。

可見，進(jìn)行不同抗逆基因多種群的雜交，可提高雜種后代的復(fù)合抗逆性，引入含美洲原產(chǎn)野生種高抗病基因，可以在山葡萄雜種后代高抗旱寒的基礎(chǔ)上，增強(qiáng)抗寒性能，提高抗病性。