馮 濤，馬博文，莊海寧，孫 敏，徐志民，楊末堯

（1.上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué) 香料香精技術(shù)與工程學(xué)院，上海 201418；2.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 食用菌研究所/家食用菌工程技術(shù)研究中心，上海 201403；3.美國路易斯安那州立大學(xué) 營養(yǎng)與食品科學(xué)學(xué)院，路易斯安那 巴吞魯日70803）

我國是世界蘋果生產(chǎn)第一大國，蘋果酒是延長產(chǎn)業(yè)鏈，增加農(nóng)副產(chǎn)品附加值的重要途徑[1]。蘋果酒是繼葡萄酒之后的第二大果酒，是用新鮮蘋果或濃縮蘋果汁為原料釀造的一種酒精飲料[2]。蘋果酒含有少量的乙醇，保留了蘋果原有的糖類、氨基酸和礦物質(zhì)等，飲用蘋果酒可以調(diào)節(jié)人體新陳代謝、促進(jìn)血液循環(huán)，軟化血管、預(yù)防心血管硬化等疾病的發(fā)生[3]。蘋果酒質(zhì)量評(píng)判是企業(yè)進(jìn)行產(chǎn)品評(píng)優(yōu)、質(zhì)量控制、產(chǎn)品分級(jí)、優(yōu)化工藝的重要方法和手段，如何系統(tǒng)、綜合地評(píng)判蘋果酒質(zhì)量，是蘋果酒產(chǎn)業(yè)發(fā)展中亟待解決的問題[4]。但目前國內(nèi)外對(duì)于蘋果酒的質(zhì)量評(píng)估還沒有具體參考的標(biāo)準(zhǔn)，往往評(píng)定一款蘋果酒好與不好主要是通過感官評(píng)分、酒精度以及某種特征香氣物質(zhì)質(zhì)量濃度等單一指標(biāo)作為評(píng)價(jià)優(yōu)化的參考值，利用傳統(tǒng)的感官品評(píng)，想要克服人的主觀隨意性也是客觀了解真實(shí)品質(zhì)的一個(gè)阻礙[5]，這些均不能全面客觀地反映酒的真實(shí)品質(zhì)。

模糊綜合評(píng)判是對(duì)多種屬性的單個(gè)事物，或者說其總體優(yōu)劣受多種因素影響的事物，作出一個(gè)能合理的綜合這些屬性或因素的總體評(píng)判[6]。應(yīng)用“隸屬函數(shù)”來描述蘋果酒風(fēng)味差異的中間過渡，為準(zhǔn)確的描述和客觀評(píng)價(jià)蘋果酒的品質(zhì)提供了數(shù)學(xué)方法[7]。該研究采用模糊綜合評(píng)價(jià)結(jié)合響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)對(duì)蘋果酒發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化[8-10]，隨之對(duì)發(fā)酵成品的香氣成分進(jìn)行檢測(cè)分析，較為全面的描述了蘋果酒的品質(zhì)特性，以期獲得更加客觀、貼近實(shí)際要求的優(yōu)化工藝參數(shù)和工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酵母菌株（葡萄酒·果酒專用酵母）：是選自山東省煙臺(tái)帝伯仕酵母有限公司；蘋果（品種為紅富士）：市售。

果膠酶（CE 3.2.1.89，＞90 000 mSU/g）、發(fā)酵助劑、焦亞硫酸鉀、皂土：煙臺(tái)帝伯仕商貿(mào)有限公司；殼聚糖（食品級(jí)）：江蘇百味科技有限公司；纖維素酶（EC 3.2.1.15，＞22 500 U/g）：上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司；L-半胱氨酸（食品級(jí)）：廣州豪翔精細(xì)化工有限公司；抗壞血酸（食品級(jí)）：鄭州裕和食品添加劑有限公司。其他試劑均為分析純，購于上海泰坦科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

VK-8002加熱破壁機(jī)：德州市歐諾華生活電器有限公司；EMS-20S磁力攪拌水浴鍋：常州市人和儀器廠；16-7383高壓滅菌鍋：上海宜川上嶺儀表有限公司；SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；WYT-4型手持糖度計(jì)：泉州中友光學(xué)儀器有限公司；LAL2T酒精濃度計(jì)：廣州市速為電子科技有限公司；6890-5973型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程及操作要點(diǎn)

蘋果→清洗、切塊→護(hù)色→榨汁→酶解分離→調(diào)糖、酸→滅菌→接種酵母→前發(fā)酵→倒罐→抽濾→后發(fā)酵→陳釀→過濾→終止發(fā)酵→蘋果酒

操作要點(diǎn)：將紅富士蘋果用水清凈晾干，去除果核，將蘋果切成3～5 cm的蘋果塊。配制復(fù)合護(hù)色液（抗壞血酸添加量為0.20%、L-半胱氨酸添加量為0.07%，焦亞硫酸鉀的添加量為0.1g/L），將蘋果塊浸泡于護(hù)色液中15 min，撈出晾干，于破碎機(jī)中榨汁[11]。分別添加60 mg/L的纖維素酶和果膠酶到蘋果果漿中，恒溫水浴55 ℃酶解1 h，靜置澄清。四層紗布過濾后，用低溫冷凍離心機(jī)5 000 r/min離心5 min，將分離得到的蘋果清汁巴氏殺菌，冷卻后加入蔗糖，調(diào)整總糖含量為18～20°Bx。在此基礎(chǔ)上添加檸檬酸調(diào)整總酸含量。

蘋果汁放入22 ℃的生化培養(yǎng)箱發(fā)酵7 d，第2天時(shí)加入已活化的帝伯仕發(fā)酵助劑（0.06～0.09 g/L）。發(fā)酵前期定時(shí)倒罐，攪拌5～15 min，發(fā)酵中期密閉發(fā)酵罐，發(fā)酵后期，當(dāng)蘋果酒的酒精度在3%vol左右，降溫至0 ℃，終止發(fā)酵。添加0.06～0.1g/L的帝伯仕皂土和殼聚糖到蘋果酒中下膠澄清，靜置澄清3～5 d后，過濾分離。4 ℃冷藏3 d后，過濾，灌裝，即得成品。

1.3.2 理化指標(biāo)測(cè)定

酒精度：按照GB/T 15038—2005《葡萄酒果酒通用分析方法》，采用酒精計(jì)法測(cè)定；總糖：使用手持測(cè)糖儀；總酸：采用電位滴定法測(cè)定[12]。

1.3.3 蘋果酒品質(zhì)的模糊綜合評(píng)判

感官評(píng)定采用百分制法，由20名經(jīng)過培訓(xùn)的具有一定感官評(píng)定經(jīng)驗(yàn)的評(píng)定員，按國標(biāo)和參考前人結(jié)果[3，5]修正后蘋果酒感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)（見表1）的要求，對(duì)各個(gè)酒樣從色澤（滿分20分）、香氣（滿分40分）、滋味（滿分30分）、風(fēng)格（滿分10分）4個(gè)方面進(jìn)行感官評(píng)定，以很好、較好、一般、較差和差為評(píng)語集，建立單因素矩陣，構(gòu)建主因素突出型綜合評(píng)判模型，采用M評(píng)判模型進(jìn)行分析[13-16]。

表1 蘋果酒感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standards of cider

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)在預(yù)試驗(yàn)結(jié)果和參考文獻(xiàn)[3-6，17-19]的基礎(chǔ)上，選取影響蘋果酒品質(zhì)的三個(gè)關(guān)鍵因子：初始pH值（A）、接種量（B）、初始糖度（C）作為試驗(yàn)考察對(duì)象，以蘋果酒的模糊綜合評(píng)判總分（Y）為因變量即響應(yīng)值，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素水平見表2。

表2 蘋果酒發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface tests

1.3.5 香氣成分分析測(cè)定方法

香氣富集方法：頂空固相微萃取法，取15 mL的頂空瓶，用無菌移液管加入10 mL待分析的蘋果酒樣和2.0 g NaCl，再加入0.3 mL 2-辛醇（質(zhì)量濃度為4.00 mg/L）作內(nèi)標(biāo)，50 ℃平衡20 min，然后將經(jīng)色譜進(jìn)樣口解吸30 min后的50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭（美國Supelci.Co.）置入頂空瓶的上部頂空中，50 ℃吸附30 min。

香氣測(cè)定儀器參數(shù)：色譜柱為DB-5（60 m×0.25 mm×0.25 μm）柱；進(jìn)樣口溫度200 ℃；柱溫：初始溫度50 ℃，保持0 min，以5 ℃/min升至150 ℃保持2.5 min，以8 ℃/min升至220 ℃后，保留5 min。質(zhì)譜條件：采用電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量為70 eV，離子源溫度為230 ℃，接口溫度為250 ℃，載氣為N2，流量為1.8 mL/min，進(jìn)樣方式為分流進(jìn)樣，分流比為50∶1，保持3 min。

定性方法：氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀得出分析總離子流圖，采用美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NIST）08質(zhì)譜庫和Wiley譜庫用計(jì)算機(jī)進(jìn)行檢索與匹配，并結(jié)合參考資料，確認(rèn)香氣成分物質(zhì)名稱。依照正構(gòu)烷烴（C7～C30）在相同時(shí)間下的保留時(shí)間，按照KOVATS保留指數(shù)公式計(jì)算揮發(fā)性物質(zhì)的保留指數(shù)（retention index，RI），得到的RI值與Wiley7n.1數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配，定性得到有效揮發(fā)性物質(zhì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 模糊數(shù)學(xué)模型的建立

2.1.1 建立評(píng)判集

依據(jù)表1對(duì)蘋果酒品質(zhì)的要求進(jìn)行模糊綜合評(píng)判，構(gòu)建主因素突出型綜合評(píng)價(jià)模型。

對(duì)象集U=｛u1，…，ui，…，un｝=｛1#，2#，…，16#，17#｝

因素集X=｛x1，…，xj，…，xn｝=｛色澤，香氣，滋味，風(fēng)格｝

評(píng)語集Y=｛y1，…，yp，…，ym｝=｛很好，較好，一般，較差，差｝

權(quán)重集W=｛w1，…，wi，…，wn｝=（0.20 0.30 0.40 0.10），其中

2.1.2 建立單因素評(píng)價(jià)矩陣

評(píng)判小組對(duì)每一因素進(jìn)行逐個(gè)評(píng)判，對(duì)每個(gè)因素的每個(gè)評(píng)語的人次進(jìn)行歸一化處理，即A=[a1*，…，ai*，…，a5*]，其中

分別統(tǒng)計(jì)每一因素xi對(duì)應(yīng)的模糊評(píng)價(jià)Rij=（ri1，ri2，…，rin）∈f（Y），可以得到每個(gè)蘋果酒樣品的因素模糊綜合評(píng)價(jià)矩陣，得到酒樣的感官評(píng)定結(jié)果見表3。

表3 不同蘋果酒的感官評(píng)定結(jié)果Table 3 Sensory evaluation results of different ciders

2.1.3 線性轉(zhuǎn)換

以1#酒樣為例，可建立色澤、香氣、滋味和風(fēng)格等4個(gè)單因素的模糊評(píng)價(jià)矩陣：

由上述結(jié)果得到1#酒樣的評(píng)判關(guān)系矩陣：

經(jīng)過模糊線性轉(zhuǎn)換[20-21]，得到模糊綜合評(píng)判矩陣：

B=W×R=（b1，…，bj，…，b5）其中，模糊算子為M（·，⊕），即bj=

經(jīng)計(jì)算得：B1=（0.395 0.35 0.205 0.03 0.02）

2.1.4 模糊綜合評(píng)判總分

設(shè)定感官特殊性[17]：很好為100分，較好為80分，一般為60分，較差為40分，差為0分，可建立感官特殊性數(shù)集V=（100 80 60 40 0），則樣品的模糊綜合評(píng)判總分為：T=B×V。得到1#蘋果酒樣品的總分為：

T1=（0.395 0.35 0.205 0.03 0.02）×（100 80 60 40 0）=81

同理可得到2#～17#酒樣的模糊綜合評(píng)判總分，見表4。

表4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Design and results of Box-Behnken tests

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

通過Design Expert 7.0軟件對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行回歸分析，預(yù)測(cè)蘋果酒發(fā)酵的最優(yōu)工藝參數(shù)，方差分析結(jié)果見表5。對(duì)表4中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合后，得到的各因素與蘋果酒感官評(píng)分（Y）影響的二次多項(xiàng)回歸模型：

從回歸模型方差中可以看出，模型的一次項(xiàng)B以及二次項(xiàng)B2、C2對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01）；一次項(xiàng)A、C和二次項(xiàng)A2對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05）；表明試驗(yàn)設(shè)計(jì)中選取的影響因素對(duì)結(jié)果影響顯著，試驗(yàn)因素變化與因變量結(jié)果之間的影響關(guān)系真實(shí)可靠。交互項(xiàng)均P＞0.05，說明因素之間無交互影響，對(duì)蘋果酒發(fā)酵的影響并不顯著，應(yīng)用該模型時(shí)可以不用考慮各因素之間的交互作用。

表5 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 5 Variance analysis of response surface methodology

由方差分析（表5）可以看出，模型的Fmodel=17.73＞F0.01（9，5）=10.16，P=0.000 5＜0.01，表明酵母接種量、初始糖度和初始pH值對(duì)蘋果酒感官評(píng)分的影響顯著；失擬項(xiàng)P=0.3649＞0.05，不顯著，說明方程不失擬，可以用該模型分析和預(yù)測(cè)蘋果酒發(fā)酵的最佳條件；蘋果酒發(fā)酵模型決定系數(shù)R2=0.958 0，說明模型擬合程度良好，試驗(yàn)誤差小，說明該模型是合適的；模型的調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.903 9，說明該模型能解釋約90.39%響應(yīng)值的變化，擬合程度較好。

離散系數(shù)（coefficient of variation，CV）反映了單位均值上的離散程度，表示實(shí)驗(yàn)的精確度，本試驗(yàn)CV=2.19%，說明實(shí)驗(yàn)操作準(zhǔn)確可信，可以用回歸方程模型對(duì)蘋果酒發(fā)酵工藝進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。

試驗(yàn)采用響應(yīng)面法優(yōu)化蘋果酒發(fā)酵條件，利用Design Expert 8.05b軟件，由二元回歸模型繪制響應(yīng)面分析圖，響應(yīng)值對(duì)各因素A、B、C的分析見圖1，直觀的反映各因素對(duì)響應(yīng)值的影響。

通過軟件分析可以確定最佳發(fā)酵工藝參數(shù)：酵母菌接種量為9.69%，初始pH值為3.46，初始糖度為19.25 g/100 mL，感官評(píng)分預(yù)測(cè)值為89.266分。為實(shí)際操作所需，修正發(fā)酵工藝參數(shù)為酵母菌接種量10%，初始pH值3.5，初始糖度19 g/100 mL，經(jīng)測(cè)定，此發(fā)酵條件下的蘋果酒酒精度為3.7%vol，總糖含量（以葡萄糖計(jì)）為16.42 g/100 mL，總酸含量（以酒石酸計(jì)）為7.9 g/L，感官評(píng)分為90分。

圖1 初始pH值、酵母接種量和初始糖度交互作用對(duì)蘋果酒感官評(píng)分的響應(yīng)面和等高線Fig.1 Response surface plots and contour line of effects of interaction between initial pH,inoculum and initial sugar content on sensory quality of cider

2.3 蘋果酒香氣成分測(cè)定

為全面驗(yàn)證最佳釀造工藝下的蘋果酒品質(zhì)的優(yōu)劣，本試驗(yàn)采用頂空固相微萃取/氣質(zhì)聯(lián)用法及氣味活度值（odor activity value，OAV）法測(cè)定蘋果酒的風(fēng)味物質(zhì)成分和關(guān)鍵香氣成分，結(jié)果見表6。

表6 蘋果酒主要香氣成分的定量分析結(jié)果Table 6 Quantitative analysis results of the main aroma components in cider

續(xù)表

由表6可知，蘋果酒中共鑒定出33種香氣成分，主要包括16種酯類（占所有香氣物質(zhì)種類總數(shù)的48.48%），9種醇類（27.27%）、4種酸類（12.12%），4種醛酮類（12.12%），與文獻(xiàn)結(jié)果[22-24]相似。各類物質(zhì)的質(zhì)量濃度從高到低分別是醇類物質(zhì)564.983 mg/L，酯類物質(zhì)42.285 mg/L，酸類物質(zhì)8.983 mg/L，醛酮類物質(zhì)2.359 mg/L。

用OAV法從蘋果酒香氣中鑒定出10種關(guān)鍵香氣組分：乙酸乙酯（4.93）、己酸乙酯（3.64）、辛酸乙酯（18.60）、戊酸乙酯（25.75）、癸酸乙酯（1.88）、肉豆蔻酸乙酯（14.00）、丁醇（137.96）、異戊醇（8.45）、苯乙醇（1.41）、辛酸（3.24）。這些物質(zhì)的OAV均大于1，對(duì)蘋果酒的整體風(fēng)味有貢獻(xiàn)。

3 結(jié)論

通過模糊綜合評(píng)判結(jié)合響應(yīng)面法對(duì)蘋果酒發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，構(gòu)建蘋果酒感官品評(píng)的主因素突出型綜合評(píng)判模型，得到最優(yōu)發(fā)酵條件為：酵母菌接種量10%，初始pH值3.5，初始糖度19 g/100 mL，此發(fā)酵條件下的蘋果酒酒精度為3.7%vol，總糖含量（以葡萄糖計(jì)）為16.42 g/100 mL，總酸含量（以酒石酸計(jì)）為7.9 g/L，感官評(píng)分為90分，與感官預(yù)測(cè)值相差不大，提高了傳統(tǒng)感官評(píng)價(jià)的準(zhǔn)確度、科學(xué)性和客觀性。利用頂空固相微萃取/氣質(zhì)聯(lián)用法和OAV法測(cè)定蘋果酒的風(fēng)味物質(zhì)成分和關(guān)鍵香氣組分，鑒定了蘋果酒的10種風(fēng)味突出貢獻(xiàn)成分為辛酸乙酯、戊酸乙酯、丁醇等物質(zhì)，為蘋果酒香氣的控制提供了理論支持。