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        miRNA-95靶向FOXD1基因?qū)Y(jié)直腸癌LoVo細胞放射敏感性的影響及其機制*

        2020-08-01 13:24:48梁宛伶肖天保曹一波顏登國
        中國應(yīng)用生理學雜志 2020年2期
        關(guān)鍵詞:X射線克隆敏感性

        梁宛伶, 肖天?!?, 袁 峰, 曹一波, 顏登國

        (1. 貴州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院肛腸外科, 貴陽 550001; 2. 四川省自貢市第一人民醫(yī)院核醫(yī)學科, 自貢 643000; 3. 貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院肛腸外科, 貴陽 550001)

        結(jié)直腸癌是常見的惡性腫瘤之一,手術(shù)切除是結(jié)直腸癌的主要治療方式。為控制癌細胞的轉(zhuǎn)移,提高結(jié)直腸癌患者的5年生存率,放化療成為常見的輔助治療手段[1]。放射治療過程中,影響治療效果的主要原因就是放射敏感性降低,而微小RNA(microRNA,miRNA)對癌癥的診斷和治療存在著巨大的潛在價值,近年來, miRNA 逐漸成為一種新型的非侵入性的疾病早期診斷的標志物[2-3]。腫瘤形成中miRNA-95發(fā)揮著不同的功能,miRNA-95在結(jié)直腸癌細胞中呈現(xiàn)上升趨勢,抑制細胞凋亡,影響腫瘤的放療敏感性,但在膠質(zhì)母細胞瘤中卻呈現(xiàn)低表達[4]。miRNA-95與腫瘤抗輻射性密切相關(guān),在某些抗輻射的腫瘤細胞中,miRNA-95會出現(xiàn)過表達,過表達miRNA-95會使肺癌細胞、結(jié)直腸癌細胞增殖并對輻射治療產(chǎn)生抗性[5]。提示miRNA-95可能成為腫瘤細胞放射敏感性的參考指標,亦可能是腫瘤治療的有效新靶點。

        叉頭框(forkheadbox,FOX)家族的成員FOXD1位于5q12染色體上,具有調(diào)控細胞周期。轉(zhuǎn)錄增強和抑制轉(zhuǎn)錄的作用[6]。目前發(fā)現(xiàn),FOXD1基因存在于真核生物組織和細胞中,在肺癌和結(jié)直腸癌中FOXD1表達異常,FOXD1過表達與不良預(yù)后相關(guān),且促進癌細胞增殖,是潛在的致癌基因[7]。但在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中,FOXD1表達升高后細胞的增殖能力和轉(zhuǎn)移能力明顯升高,但與臨床預(yù)后無關(guān)。由此本文通過建立轉(zhuǎn)染細胞分組進行X射線照射實驗,探討miRNA-95靶向FOXD1基因?qū)Y(jié)直腸癌細胞LoVo細胞放射敏感性的有機制研究。

        1 材料與方法

        1.1 主要試劑和儀器

        上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司生產(chǎn)的miR-133b模擬物(miRNA-95-mimics)。抑制物(miRNA-95-inhibitions),上海博升生物科技有限公司生產(chǎn)的RPMI-1640培養(yǎng)基,上海撫生實業(yè)有限公司生產(chǎn)的CCK-8檢測試劑盒。BCA蛋白濃度測定試劑盒,北京中科科爾儀器有限公司生產(chǎn)的Real-time PCR儀,30只BALB/C-nu雄性裸鼠購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心,8周齡,體質(zhì)量(20 g±2 g),結(jié)直腸癌LoVo細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

        1.2 裸鼠成瘤實驗

        相同轉(zhuǎn)染而未經(jīng)X射線照射的C組、M組、I組LoVo細胞,制成細胞濃度為5×107cells/ml的細胞懸液,各取0.2 ml分別接種于C組、M組、I組BALB/C-nu雄性裸鼠左下肢足部皮上1次,每組10只,注射2周后,待腫瘤生長至100 mm3時,各組選取5只裸鼠進行X射線照射,每天4 Gy 照射一次,連續(xù)照射15 d,其余小鼠不照射,15 d后處死裸鼠并取出腫瘤進行稱重。

        1.3 細胞培養(yǎng)

        在RPMI-1640培養(yǎng)基加入含10%胎牛血清,再加入1%氰基鏈霉素,將LoVo細胞放入培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng),培養(yǎng)條件:溫度37℃,CO2濃度5%,待細胞生長至80%~90%時,離心傳代,收集細胞進行后續(xù)實驗。

        1.4 細胞分組與實驗設(shè)計

        傳代培養(yǎng)時,每2周用濃度為2 mg/ml的DDP進行沖洗,然后加入2 ml濃度1×105cells/well對數(shù)生長期細胞接種于6孔板中,細胞生長至60%~70%時,按照說明書取50 pmol miRNA-95-mimics、miRNA-95-inhibitions加入無血清稀釋液,制成25 μl的RNA稀釋液與Lipofectamine2000混合,然后將含有miRNA-95-mimics、miRNA-95-inhibitions以Lipofectamine2000為載體分別在LoVo細胞中轉(zhuǎn)染miRNA-95-mimics。miRNA-95-inhibitions,并分組:C組(對照組正常LoVo細胞),M組(miRNA-95-mimics轉(zhuǎn)染LoVo細胞),I組(miRNA-95-inhibitions轉(zhuǎn)染LoVo細胞),48 h后轉(zhuǎn)染成功,胰蛋白酶消化后收集細胞懸液,于24孔板中接種細胞懸液,室溫放置培養(yǎng)24 h,利用直線加速器6 MV/8 Gy的X射線垂直照射細胞,劑量率3 Gy/min,照射12 h后收集細胞。采用RT-PCR法檢測LoVo細胞中FOXD1的表達情況,流式細胞術(shù)檢測LoVo細胞凋亡情況,Western blot檢測細胞中FOXD1蛋白的水平,細胞克隆測定細胞存活率,裸鼠成瘤實驗檢測X射線照射后的裸鼠腫瘤體積。

        1.5 細胞克隆測定LoVo細胞存活率

        將8 GyX射線照射后的細胞種植到含 10 ml 培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中,37℃環(huán)境下培養(yǎng),孵育 14 d 細胞克隆成功,用 4% 多聚甲醛固定細胞15 min,加入結(jié)晶紫染色液,染色時長 20 min,計數(shù)細胞克隆數(shù),對各組細胞存活率進行計算??寺⌒纬陕?%) = (形成的細胞克隆數(shù)/ 接種細胞數(shù))× 100%。

        1.6 RT-PCR法檢測照射后LoVo細胞中FOXD1的表達

        裂解LoVo細胞提取RNA,根據(jù)FOXD1和β-actin基因序列號進行引物。FOXD1產(chǎn)物片287 bp。β-actin產(chǎn)物262 bp,RT-PCR反應(yīng)體系為10 μl的滅菌ddH2O,上游引物 0.5 μl。下游引物與其相同。通過Trizol提取RNA定量,將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,PCR反應(yīng)條件:97℃6 min,98℃28 s,75℃30 s,80℃4 min,總計55個循環(huán)。實驗重復(fù)3次,用β-actin作參考將PCR產(chǎn)物電泳,用相對定量2-ΔΔCT計算FOXD1水平,引物序列如表1。

        Tab. 1 Primer Sequences of PCR

        1.7 流式細胞術(shù)檢測照射后LoVo細胞凋亡情況

        三組LoVo細胞以2×110cells/ml濃度置于6孔板,培養(yǎng)24 h,用0.25%胰蛋白酶消化細胞,用冷的70%的乙醇固定,4℃放置一天,后離心5 min倒掉上清液,用PBS洗滌5 min,重復(fù)三次。在37℃。無光照下染色30 min,用流式細胞儀分析三組細胞凋亡程度。

        1.8 Western blot檢測細胞中FOXD1蛋白的水平

        取三組LoVo細胞,加入細胞裂解液,提取總蛋白測定濃度,在100 V SDS-PAGE對總蛋白進行電泳,蛋白樣品采用Bradford法定量,將電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)至PVDF 膜上,用10%的山羊血清,封閉0.5 h,分別加入一抗4°C孵育過夜,二抗常溫孵育1 h,常溫環(huán)境下洗膜三次,β-Actin 作內(nèi)參,用Quantity one 4.0軟件分析FOXD1蛋白表達。

        1.9 統(tǒng)計學處理

        2 結(jié)果

        2.1 各組LoVo細胞中FOXD1的表達情況

        RT-PCR法用于檢測C組、M組、I組LoVo細胞中FOXD1的表達水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)C組細胞中FOXD1表達為(3.62±1.02),M組細胞中FOXD1表達為(5.21±1.67),I組細胞中FOXD1表達為(2.34±0.95),下調(diào)I組LoVo細胞中miRNA-95表達后,FOXD1表達明顯降低,M組LoVo細胞中miRNA-95表達增加,FOXD1表達也明顯升高(P<0.05,圖1,表2)。

        Fig. 1 Expression of FOXD1 in loVo cells of each group

        2.2 各組LoVo細胞凋亡變化

        流式細胞術(shù)檢測顯示,在同樣8 Gy 照射后,I組細胞凋亡率高于C組,而M組細胞凋亡率顯著下降, C組LoVo細胞凋亡率(25.03±3.29),M組(16.23±2.96),I組(40.01± 4.32)(P<0.05,圖2,表2)。

        Fig. 2 Apoptosis of Lovo cells in each group

        Tab. 2 Comparison of FOXD1 expression in loVo cells of different n=3)

        2.3 各組LoVo細胞中FOXD1蛋白表達

        Western blot檢測FOXD1蛋白表達,轉(zhuǎn)染miRNA-95-mimics模擬物后M組FOXD1蛋白(5.35±1.74)表達上升,轉(zhuǎn)染miRNA-95-inhibitions抑制物I組FOXD1蛋白表達 (2.45±1.12)降低,M組FOXD1蛋白顯著高于C組(3.75± 1.23)(P<0.05),I組FOXD1蛋白顯著低于C組(P<0.05,圖3)。

        Fig. 3 Effect of FOXD1 expression on loVo cells in each group

        2.4 細胞克隆測定各組LoVo細胞的存活率

        細胞克隆實驗檢測發(fā)現(xiàn)在8 Gy照射后,C組、M組及I組LoVo細胞的存活率分別為(42.36±2.52)%、(50.51± 3.03)%、(30.23±2.03)%,與I組比對,M組和C組LoVo細胞的單克隆存活率有上升趨勢(P<0.05,圖4)。

        2.5 X射線照射對裸鼠結(jié)直腸癌移植瘤的影響

        無照射結(jié)果:與M組相比,C組和I組腫瘤體積減少(P均<0.05,表3),與C組比較,I組腫瘤體積減少(P<0.05)。X射線照射結(jié)果:照射15 d后I組裸鼠腫瘤體積顯著減小,與M組相比,C組和I組腫瘤體積減少(P均<0.05),三組裸鼠中I組腫瘤體積最小,M組腫瘤體積最大,C組次之,無照射裸鼠腫瘤體積顯著大于X射線照射組(P<0.05),表明X射線照射可抑制細胞生長,miRNA-95低表達,結(jié)直腸癌種植瘤放射敏感性提高,腫瘤的生長得到明顯抑制。

        Tab. 3 Tumor volume comparison of colorectal cancer in nude n=5)

        3 討論

        近十年來,結(jié)直腸癌嚴重威脅著人類的身體健康,我國結(jié)直腸癌發(fā)病率約占全球的24%,死亡率約占22%[8]。目前,臨床治療手段有限,放化療效和手術(shù)預(yù)后較差,如果通過合理的綜合治療,腸癌的五年生存期可達到80%以上。大量文獻報道,FOXD1在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用,參與癌細胞的增殖和分化[9]。有研究證實,miRNA-95過表達會使乳腺癌細胞、直腸癌細胞增殖并對輻射治療產(chǎn)生抗性,提示miRNA-95可能成為腫瘤細胞放射敏感性的參考指標[10]。我們利用流式細胞術(shù)檢測miRNA-95的表達對LoVo細胞凋亡的影響,發(fā)現(xiàn)同樣在8 Gy照射后,miRNA-95抑制物組細胞凋亡率高于對照組,而miRNA-95模擬物組細胞凋亡率顯著下降,證實miRNA-95表達與結(jié)直腸癌的發(fā)生密切相關(guān)。2009年Arndt等[11]發(fā)現(xiàn)在早期(Ⅰ期。Ⅱ期)結(jié)直腸癌組織中的miRNA-95表達呈上升趨勢且高于正常組織。更進一步研究結(jié)直腸癌發(fā)生中的miRNA-95的作用,2011年Huang等[12]發(fā)現(xiàn)有機體內(nèi)和體外miRNA-95都出現(xiàn)過表達,對結(jié)直腸癌細胞凋亡產(chǎn)生抑制作用,使患者放療敏感性大大降低。

        近年來的研宄提示FOXD1也參與了癌癥的發(fā)生和發(fā)展過程,本研究利用Western blot和RT-PCR法檢測不同表達水平的miRNA-95對FOXD1表達的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)下調(diào)LoVo細胞中miRNA-95表達后,FOXD1表達明顯降低,上調(diào)LoVo細胞中miRNA-95表達,FOXD1表達也明顯升高,轉(zhuǎn)染miRNA-95模擬物后FOXD1蛋白表達上升,miRNA-95抑制物則降低FOXD1蛋白的表達,提示了解結(jié)直腸癌患者miRNA-95表達水平可以預(yù)測其接受放療效果。有研究發(fā)現(xiàn)在miRNA-95在胰腺癌組織及子宮內(nèi)膜癌中表達異常,下調(diào)miRNA-95表達能有效抑制胰腺癌及子宮內(nèi)膜癌細胞的侵襲、遷移,其表達與癌癥的發(fā)生、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)[13]。FOXD1 基因存在于真核生物組織和細胞中,F(xiàn)OXD1激活主要受到多種因素調(diào)節(jié),其中主要的激活方式是被磷酸化,磷酸化FOXD1從細胞核轉(zhuǎn)移至細胞漿中發(fā)揮作用,在各種細胞、組織、器官中表現(xiàn)活躍,F(xiàn)OXD1活性的變化會影響細胞的穩(wěn)定性,當FOXD1活化可以穩(wěn)定細胞,促進細胞增殖[14]。研究發(fā)現(xiàn)FOXD1是直腸癌潛在的致癌基因,在直腸癌組織呈上升趨勢,敲低 FOXD1 的表達可抑制直腸癌細胞的增殖活性[15]。大量文獻報道,結(jié)直腸癌LoVo細胞的凋亡會受到FOXD1過表達的影響,還會對化療藥物的產(chǎn)生耐藥性。靶向基因調(diào)控FOXD1的表達影響放射的敏感性,監(jiān)測FOXD1表達是分子作用機制和生物學功能的重點[16-17]。

        8 Gy照射后,miRNA-95抑制物組單克隆群數(shù)最少,腫瘤體積最小,顯著低于對照組和miRNA-95模擬物組。miRNA-95模擬物組單克隆群數(shù)及腫瘤體積均高于對照組。抑制miRNA-95的表達后FOXD1降低,提高了LoVo細胞的放射敏感性,LoVo細胞裸鼠移植瘤的生長受到抑制,提高患者腫瘤放療效果,miRNA與腫瘤放療敏感性相關(guān),miRNA-95能夠影響多種癌癥放射抵抗性,并在癌細胞系中高表達。有研究發(fā)現(xiàn)miRNA-95在放療敏感的宮頸癌腫瘤組織和輻照敏感的宮頸癌細胞中均呈低表達,而抑制miRNA-95 表達水平能夠顯著提高宮頸癌細胞的輻射敏感性[18]。相關(guān)研究證實,結(jié)直腸癌細胞中FOXD1表達會隨著放射劑量的升高而增長,具有一定依賴性,當FOXD1降低后,直腸癌細胞的放射敏感性隨之提高,癌細胞出現(xiàn)大量死亡[19],F(xiàn)OXD1基因與直腸癌放療敏感或抵抗密切相關(guān),F(xiàn)OXD1基因高表達與放療抵抗有關(guān),降低FOXD1基因表達,放射可抑制癌細胞發(fā)展[20]。

        綜上所述,miRNA-95低表達可抑制FOXD1蛋白的活性,提高LoVo細胞的放射敏感性,促進細胞凋亡,提高腫瘤放療效果。

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