計 紅， 邵子益， 薛琳琳， 牛春陽， 詹雪龍， 楊 闖， 甄 莉， 楊煥民， 李士澤△

(1. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院， 黑龍江 大慶 163319， 2. 黑龍江職業(yè)學(xué)院， 黑龍江 雙城 1501113)

α-烯醇化酶(α-enolase, ENO1)屬于烯醇化酶家族，目前在多數(shù)組織中都可檢測到ENO1的表達(dá)。資料顯示，ENO1是一種多功能蛋白，研究最多的是ENO1在癌癥發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤，神經(jīng)母細(xì)胞瘤和其他類型的癌癥細(xì)胞都檢測到其表達(dá)[1]，提示癌癥的發(fā)生均與ENO1有密切關(guān)系。Song等發(fā)現(xiàn)ENO1作為一種潛在的癌癥預(yù)后標(biāo)志物，可促進(jìn)細(xì)胞生長，遷移和侵襲[2]。作為腫瘤細(xì)胞表面的纖維蛋白溶解酶原受體，ENO1可誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)降解，腫瘤發(fā)生和癌癥細(xì)胞侵襲[3]。ENO1與機(jī)體免疫反應(yīng)也有密切關(guān)系。Ray研究顯示，用ENO1抑制劑可激活多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞，并增加其誘導(dǎo)的特異性CD8+ CTL和NK細(xì)胞抗自體腫瘤細(xì)胞的活性，提示ENO1在該疾病免疫系統(tǒng)中具有重要作用[4]。Li等發(fā)現(xiàn)ENO1的自身抗體含量可作為骨肉瘤免疫診斷的潛在生物標(biāo)志物，提示其可在免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用[5]。ENO1與角膜上皮細(xì)胞的增殖相關(guān)[6]。ENO1還可與熱休克蛋白的功能相似，可以結(jié)合細(xì)胞骨架和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，提示其可能在細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和各種病理生理過程中具有重要作用[7]。此外，ENO1基因的編碼產(chǎn)物也是值得深入研究的領(lǐng)域，如白色念珠菌ENO1基因編碼轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，參與生長，細(xì)胞分裂，形態(tài)發(fā)生和滲透保護(hù)[8]。

卵泡是動物機(jī)體生長最快的正常組織，禽類卵泡細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的增殖都非常迅速，而細(xì)胞的增殖需要大量的能量。腫瘤細(xì)胞可通過糖的無氧酵解來獲取能量，Capello等證實ENO1是調(diào)控腫瘤代謝，促進(jìn)腫瘤Warburg效應(yīng)的主要調(diào)節(jié)分子[9]。東北籽鵝是東北地區(qū)傳統(tǒng)優(yōu)勢鵝種，對其產(chǎn)蛋性能的研究具有重要價值。本課題組在前期實驗發(fā)現(xiàn)，ENO1可能與籽鵝卵泡生長發(fā)育和卵泡選擇存在密切關(guān)系[10]。因此，本研究采用原代培養(yǎng)產(chǎn)蛋期籽鵝卵泡顆粒細(xì)胞，通過轉(zhuǎn)染發(fā)夾RNA(shRNA)干擾表達(dá)ENO1基因的方式，分析其對籽鵝卵泡顆粒細(xì)胞增殖、凋亡的影響，探討ENO1在禽類生殖生理中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

WST-1細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)；細(xì)胞周期檢測試劑盒(美國BD Biosciences公司)；RNA提取及熒光定量PCR相關(guān)試劑(寶生物工程大連有限公司)；Solarbio血清(索萊寶公司)；M199培養(yǎng)液(美國Hyclone 公司)；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(美國Invitrogen公司)；GPU6/GFP/Neo載體(上海吉瑪基因股份有限公司)。

1.2 實驗材料、分組與處理

從黑龍江省大慶市大同區(qū)北方種鵝場購買的8月齡產(chǎn)蛋期籽鵝，處死后取F1級卵泡，分離卵泡顆粒層細(xì)胞，加入含10%胎牛血清的M199培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)[11]。籽鵝卵泡顆粒細(xì)胞原代培養(yǎng)72 h換液，24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染實驗。本實驗分為4組：ENO1干擾表達(dá)組(RNAi)、無關(guān)序列干擾組(NC)、培養(yǎng)液組(Control)、轉(zhuǎn)染試劑組(Lip)。每組各設(shè)3個重復(fù)(n=3)。ENO1干擾表達(dá)組即將ENO1干擾表達(dá)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至卵泡顆粒細(xì)胞組；無關(guān)序列干擾組即將無關(guān)序列干擾表達(dá)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至卵泡顆粒細(xì)胞組；培養(yǎng)液組即正常細(xì)胞對照組；轉(zhuǎn)染試劑組即只添加轉(zhuǎn)染試劑的顆粒細(xì)胞組。ENO1干擾表達(dá)重組質(zhì)粒在前期實驗中已構(gòu)建完成。每孔(12孔板)干擾質(zhì)粒和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染劑量為4 μl和6 μl。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞待用。表達(dá)量檢測引物為：F: GCTGATGCTCCCATGTTCGTGAT；R: GTGGTGCAAGAGGCAT TGCTGAC。內(nèi)參基因為GAPDH，引物為：F: GCTGATGCTCCCATGTTC GTGAT；R: GTGGTGCAAGAGGCATTGCTGAC。

1.3 各組籽鵝卵泡顆粒細(xì)胞生長曲線的測定

通過WST-1(水溶性四唑鹽試劑)法測定各組顆粒細(xì)胞數(shù)，在450 nm波長下檢測吸光值。

1.4 籽鵝卵泡顆粒細(xì)胞凋亡率的測定

采用Annexin V-PE細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測各組顆粒細(xì)胞凋亡率。

1.5 籽鵝卵泡顆粒細(xì)胞細(xì)胞周期時相性的測定

采用PI單染法檢測顆粒細(xì)胞細(xì)胞周期時相性。

1.6 籽鵝卵泡顆粒細(xì)胞Bcl-2與Caspase-3 mRNA表達(dá)量的測定

采用熒光定量PCR技術(shù)檢測Bcl-2與Caspase-3 mRNA表達(dá)量。Bcl-2基因引物如下：F: TGAGGCCTTTGTTCGATTTC；R: GCCAGGAAGTTGTTTTGCTC。Caspase-3基因引物如下：F: GATGCAGATGCTGCAAGTGT；R: GAGGGCCATCTGTACCATAGA。

1.7 數(shù)據(jù)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 ENO1基因干擾表達(dá)重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染結(jié)果

將ENO1干擾表達(dá)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至原代培養(yǎng)的籽鵝顆粒細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后轉(zhuǎn)染效率可以達(dá)到70%以上(圖1)。

Fig. 1 Transfection of shRNA-ENO1 in granulosa cells (uncoulored ×200)

2.2 ENO1基因干擾表達(dá)對顆粒細(xì)胞增殖的影響

各組顆粒細(xì)胞生長曲線均呈“S”形曲線。各組細(xì)胞生長96 h數(shù)量沒有顯著差異。Control組細(xì)胞生長較快，對數(shù)生長期為96～192 h；RNAi組、NC組和Lip組對數(shù)生長期為120～216 h。對數(shù)生長期內(nèi)RNAi組細(xì)胞數(shù)量顯著低于其他各組(P<0.05，表1)。

Tab. 1 The growth curve of granulosa cells transfected with shRNA-ENO1 (×105 cells/ml, n=3)

2.3 ENO1基因干擾表達(dá)對顆粒細(xì)胞凋亡率的影響

熒光定量結(jié)果顯示RNAi組ENO1 mRNA表達(dá)量比Control組、NC組和Lip組都極顯著降低(P< 0.01，表2)。

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果(圖2，表2)顯示RNAi組G-mean值與NC組差異顯著(P<0.05)，與Control組和Lip組差異極顯著(P<0.01)。

Fig. 2 Apoptosis of granulosa cells transfected with shRNA-ENO1 after 48 h

Tab. 2 ENO1 mRNA and apoptosis of granulosa cells transfected with shRNA-ENO1 after 48 h n=3)

2.4 ENO1基因干擾表達(dá)對顆粒細(xì)胞周期的影響

RNAi組與NC組G0/G1期細(xì)胞比例沒有顯著差異；與NC組和Control組S期細(xì)胞比例差異極顯著(P<0.01)；與Control組、NC組及Lip組G2/M期細(xì)胞比例差異極顯著(P<0.01，圖3，表3)。

Fig. 3 Cell cycle of granulosa cells transfected with shRNA-ENO1 after 48 h

Tab. 3 Cell cycle of granulosa cells transfected with shRNA-ENO1 after 48 h n=3)

2.5 ENO1基因干擾表達(dá)對顆粒細(xì)胞Bcl-2與Caspase-3 mRNA表達(dá)量的影響

與Control組、NC組及Lip組相比，RNAi組的Bcl-2 mRNA表達(dá)量下調(diào)(P<0.05)；Caspase-3 mRNA表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05，表4)。

Tab. 4 Bcl-2 and Caspase-3 mRNA expressions in the granulosa cells transfected with shRNA-ENO1 after 48 h n=3)

3 討論

ENO1是一種關(guān)鍵的糖酵解酶，可導(dǎo)致已知的“瓦博格效應(yīng)”，即癌細(xì)胞的高糖酵解速率，卻不產(chǎn)生高效的能源[12]。研究發(fā)現(xiàn)，ENO1在多種腫瘤中高表達(dá)，廣泛參與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲以及轉(zhuǎn)移，在腫瘤代謝方面發(fā)揮著重要作用[13-14]。近年來，在癌癥疾病中廣泛觀察到ENO1的異常調(diào)節(jié)。例如，ENO1是肝細(xì)胞癌的潛在生物標(biāo)志物[15]。ENO1也是一種多功能蛋白，廣泛存在于動物機(jī)體各個組織、器官之中，參與多種生物學(xué)過程。樊等發(fā)現(xiàn)ENO1在生物界普遍表達(dá)，其表達(dá)量與細(xì)胞病理生理狀況、代謝狀態(tài)或分裂狀態(tài)有關(guān)[16]?？焖僭鲋呈悄[瘤細(xì)胞的特點，研究表明，癌癥細(xì)胞存在糖酵解作用取代有氧循環(huán)的現(xiàn)象[17]，因為糖酵解能力的增強(qiáng)(等同于乳酸的產(chǎn)生)為細(xì)胞生長和增殖提供必要的合成代謝支持[18]。作為家禽生長速度最快的正常組織，卵泡與癌癥具有相似的增殖速度，提示其可能也是通過有氧糖酵解獲得生長發(fā)育必須的能量。Nutt等研究表明，卵母細(xì)胞的生長發(fā)育需要顆粒細(xì)胞提供能量。當(dāng)缺乏卵丘顆粒細(xì)胞時，體外培養(yǎng)的卵母細(xì)胞在含有葡萄糖的培養(yǎng)基中也不能生長，同時發(fā)現(xiàn)卵泡內(nèi)糖代謝途徑的選擇決定了卵泡發(fā)育的最終命運[19]，而導(dǎo)致卵泡發(fā)育的命運之一—卵泡閉鎖的一個直接原因就是顆粒細(xì)胞的凋亡[20]。

本實驗通過轉(zhuǎn)染發(fā)夾RNA敲低ENO1的表達(dá)水平，研究了ENO1基因沉默對卵泡顆粒細(xì)胞增殖和凋亡的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，顆粒細(xì)胞ENO1基因沉默后細(xì)胞增殖速度變慢，細(xì)胞凋亡增加，這與ENO1基因?qū)δ承┌┘?xì)胞的作用相似。高等發(fā)現(xiàn)干擾ENO1后明顯抑制K562/A02(人慢性粒細(xì)胞白血病耐藥細(xì)胞株)細(xì)胞生長[21]。Zuo等研究顯示糖酵解酶ENO1與1型跨膜糖蛋白B7-H3相互作用，促進(jìn)HeLa細(xì)胞的惡性化和糖酵解過程，進(jìn)而促進(jìn)其增殖[22]。上述實驗結(jié)果與本實驗結(jié)果一致，也提示快速增殖細(xì)胞的生長速度與糖酵解過程密切相關(guān)。此外，ENO1定位于細(xì)胞質(zhì)時對腫瘤細(xì)胞的生長和運動具有促進(jìn)作用[23]，定位于細(xì)胞核時則可抑制腫瘤細(xì)胞的生長[20]，這也提示本實驗ENO1基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染使細(xì)胞質(zhì)中ENO1表達(dá)量降低，進(jìn)而抑制顆粒細(xì)胞的增殖。由于ENO1可催化2-磷酸甘油酸為含有高能磷酸鍵磷酸烯醇式丙酮酸，再被作用產(chǎn)生ATP和丙酮酸[24]。本實驗中細(xì)胞增殖速度降低，可能是因為磷酸烯醇式丙酮酸生成量減少，ATP含量降低導(dǎo)致。

王等研究發(fā)現(xiàn)ENO1過表達(dá)使卵泡顆粒細(xì)胞Bcl-2基因表達(dá)量極顯著上調(diào)[25]，本實驗表明，ENO1干擾表達(dá)可使其表達(dá)量下調(diào)，與其研究結(jié)果一致。本實驗中ENO1的干擾表達(dá)后顆粒細(xì)胞生長速度變慢，凋亡率升高，這與Bcl-2及Caspase-3基因表達(dá)量變化結(jié)果一致。Caspase-3處于細(xì)胞凋亡信號通路下游，對腫瘤細(xì)胞的研究也顯示，Caspase-3使bax基因與bcl-2基因表達(dá)失去固有的平衡，使凋亡基因bax占主導(dǎo)地位，從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[26]。有趣的是，Ucker研究發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞表面含有豐富的ENO1，但是ENO1卻不具備糖酵解活性，表明ENO1與凋亡密切相關(guān)[27]。本實驗中發(fā)現(xiàn)ENO1干擾表達(dá)后顆粒細(xì)胞凋亡增加，細(xì)胞周期時相性發(fā)生改變，Caspase-3 mRNA表達(dá)量升高。羅等發(fā)現(xiàn)，ENO1干擾表達(dá)導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細(xì)胞的葡萄糖攝取能力和乳酸產(chǎn)生能力明顯降低[28]，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期轉(zhuǎn)化能力也明顯下降，這與本研究結(jié)果一致。Sun等研究表明，ENO1通過蛋白激酶B(AKT)信號通路增強(qiáng)胃癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，表明ENO1/AKT信號軸可能成為治療胃癌細(xì)胞的潛在靶標(biāo)[29]。這些都提示ENO1對細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期存在明確調(diào)控作用。

本實驗發(fā)現(xiàn)ENO1干擾表達(dá)籽鵝卵泡顆粒細(xì)胞G2/M期細(xì)胞比例升高，說明ENO1對其細(xì)胞周期具有明顯影響。G2/M期和S期是細(xì)胞增殖的重要階段，資料顯示細(xì)胞在G2/M期難以修復(fù)時會被誘導(dǎo)凋亡，而輕微損傷則允許繼續(xù)存活[30]。綜合本實驗各項結(jié)果，推測ENO1基因干擾可以使原代培養(yǎng)的籽鵝卵泡顆粒細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯，損傷難以修復(fù)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖。

綜上，本研究表明ENO1基因干擾表達(dá)可使籽鵝卵泡顆粒細(xì)胞周期發(fā)生G2/M期阻滯，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，抑制細(xì)胞增殖。