楊尊敬， 杜先玲

(恩施州中心醫(yī)院腫瘤科， 湖北 恩施 445000)

全世界每年約有220,000名女性患卵巢癌，是發(fā)達(dá)國(guó)家婦科惡性腫瘤相關(guān)癌癥死亡的第四大原因[1]。卵巢癌可分為六個(gè)亞組，即漿液性，粘液性，子宮內(nèi)膜樣，移行細(xì)胞癌，透明細(xì)胞癌和鱗狀細(xì)胞癌[2]。Feng Y等人[3]通過(guò)微陣列數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)miR-193a-5p為改善卵巢癌的化療敏感性的潛在靶標(biāo)。Ren X等人[4]發(fā)現(xiàn)miR-193a-5p可提高卵巢癌的診斷能力，可以作為候選生物標(biāo)志物。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶14(Cyclin-Dependent Kinase 14, CDK14)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)[5]。Zhang W等人[6]發(fā)現(xiàn)CDK14的表達(dá)與多種臨床病理因素相關(guān)，包括腫瘤分級(jí)，F(xiàn)IGO分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，Ki-67表達(dá)，并影響卵巢癌細(xì)胞增殖，遷移和侵襲。CDK14也可調(diào)控癌癥細(xì)胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)變(epithelial‐mesenchymal transition, EMT)[7]。然而，miR-193a-5p與CDK14在卵巢癌細(xì)胞OVAC中的關(guān)系仍未報(bào)道。基于此，本研究旨在探討miR-193a-5p與CDK14在卵巢癌細(xì)胞OVAC增殖和EMT之間的關(guān)系，為使用miRNA治療卵巢癌提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

miR-193a-5p序列來(lái)自miRBase(http://www.mirbase.org/)，miR-193a-5p mimics和miR-193a-5p inhibitor由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。miR-193a-5p SYBR Green miRNA熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自HaiGene公司(貨號(hào)：AP02314、批號(hào)：CUDIV6B2)。miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒購(gòu)自上海滬震實(shí)業(yè)有限公司(貨號(hào)：HZ130911-25、批號(hào)：IU13I1)。CDK14, E-cadherin，vimentin、fibronectin、TUBULIN抗體購(gòu)自abcam公司(貨號(hào)：ab175489、批號(hào)：46731034134；ab1416、批號(hào)：06137773828；ab8978、批號(hào)：97772918624；ab32419、批號(hào)：97299240093；ab32124、批號(hào)：13573127795)。OVAC細(xì)胞購(gòu)自廈門(mén)慧嘉生物科技有限公司(貨號(hào)：X1278、批號(hào)：GB1BK1)。RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自武漢純度生物科技有限公司(貨號(hào)：CD-100043GM、批號(hào)：O58963)，優(yōu)級(jí)胎牛血清購(gòu)自浙江天杭生物科技股份有限公司(貨號(hào)：11011-8611、批號(hào)：F40I58SOSD26EYZ)。蛋白酶抑制劑Cocktail (不含EDTA, mini片劑) 購(gòu)自bimake公司(貨號(hào)：B14011、批號(hào)：K6LJZ3NF)。PBS購(gòu)自天津泰澤興業(yè)生物科技有限公司(貨號(hào)：MA0015、批號(hào)：3FBJ9FYKVDD3LA5)。青鏈霉素混合液(100×)購(gòu)自上海億言生物科技有限公司(貨號(hào)：SL6040-100 ml、批號(hào)：CQ83GF1KGP16)。2×SDS 蛋白電泳上樣緩沖液購(gòu)自上海樊克生物科技有限公司(貨號(hào)：FK-ZH536J、批號(hào)：9HHKR0Q3)?？焖俚鞍琢呀庖嘿?gòu)自上海信裕生物科技有限公司(貨號(hào)：XY-3221-1、批號(hào)：H867MTG8R17C0-P)。cyclofect轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自大連興典生物科技有限公司(貨號(hào)：cyclofectalpha001a、批號(hào)：KT1YPT3Q)。P3mirGLO質(zhì)粒購(gòu)自優(yōu)寶生物公司(貨號(hào)：VT1439、批號(hào)：NT98-WBKH8WPK-2)。Luciferase熒光素酶報(bào)告檢測(cè)試劑盒購(gòu)自齊一生物科技(上海)有限公司(貨號(hào)：K801-200、批號(hào)：63698282970)。MTT試劑盒購(gòu)自上海浩然生物技術(shù)有限公司(貨號(hào)：M2128、批號(hào)：1W3BQQS8HBV)。CCK-8試劑盒購(gòu)自南京恩晶生物科技有限公司(貨號(hào)：E1CK-00208、批號(hào)：406MIKO2)。

1.2 熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)檢測(cè)miR-193a-5p靶向CDK14

將CDK14的3‘UTR克隆進(jìn)P3mirGLO質(zhì)粒，同時(shí)克隆CDK14的3‘UTR的UG突變進(jìn)P3mirGLO質(zhì)粒。將每孔總共5×104個(gè)OVAC細(xì)胞接種在24孔板中。培養(yǎng)24 h后，用含有200 ng/ml雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒和40 nmol/L miR-193a-5p mimics混合后轉(zhuǎn)染細(xì)胞。使用熒光素酶報(bào)告檢測(cè)試劑盒在轉(zhuǎn)染后24 h通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)量熒光素酶活性。所有轉(zhuǎn)染獨(dú)立重復(fù)至少三次。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

卵巢癌細(xì)胞OVAC在37℃ 5% CO2含有100 U/ml青霉素-100 μg/ml鏈霉素和10%熱滅活的FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中孵育。通過(guò)cyclofect轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞OVAC。將miR-193a-5p mimics或miR-193a-5p inhibitor與cyclofect脂質(zhì)體混合，靜止大約20 min后，緩緩滴入OVAC細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24 h進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-193a-5p的相對(duì)表達(dá)量

將卵巢癌細(xì)胞OVAC用細(xì)胞刮刮下，裝入 1.5 ml的EP管中，用PBS洗3次。使用miRNA快速提取試劑盒抽取OVAC的miRNA。使用miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將純化好的總miRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。用miR-193a-5p SYBR Green miRNA熒光定量PCR試劑盒在ABI7500儀器上進(jìn)行qPCR反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。使用2-ΔΔct值表示結(jié)果。

1.5 免疫印跡檢測(cè)CDK14、E-cadherin、vimentin、fibronectin、TUBULIN的表達(dá)

進(jìn)行10%SDS-PAGE的電泳[8]，然后轉(zhuǎn)移到Immobilon-P PVDF膜(0.45 μm孔徑)。將PVDF膜在室溫下在含有0.01%Tween-20和5%脫脂奶粉的Tris緩沖鹽水(10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5,150 mmol/L NaCl)中封閉1 h，然后在4℃下與目的蛋白的抗體(CDK14：1∶1 000, E-cadherin：1∶3 000，vimentin：1∶3 000、fibronectin：1∶3 000、TUBULIN：1∶8 000)溫育過(guò)夜后將膜在室溫下與綴合有HRP的相應(yīng)二抗孵育1 h。用ECL Plus Western印跡檢測(cè)系統(tǒng)觀察特定蛋白質(zhì)[9]。

1.6 MTT試驗(yàn)檢測(cè)UVAC細(xì)胞活力

第1日用卵巢癌細(xì)胞OVAC細(xì)胞，將OVAC細(xì)胞稀釋至7.5×104cells/ml。向96孔板的每個(gè)孔中加入100 μl細(xì)胞并孵育過(guò)夜。第2日進(jìn)行過(guò)表達(dá)miR-193a-5p或者基因沉默miR-193a-5p處理細(xì)胞。第3日，向每個(gè)孔中加入20 μl 5 mg/ml MTT。在培養(yǎng)箱中37℃孵育3.5 h。用錫箔覆蓋并在軌道振蕩器上攪拌細(xì)胞15 min。讀取590 nm處的吸光度。

1.7 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)UVAC細(xì)胞增殖

在96孔板中分配100 μl OVAC細(xì)胞懸浮液(5×103cells/ml)。將板在潮濕的培養(yǎng)箱中預(yù)孵育24 h(37℃，5% CO2條件下)。將10 μl不同濃度的待測(cè)物質(zhì)加入板中。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)?shù)臅r(shí)間(0 d、1 d、2 d、3 d、4 d)。再向每個(gè)孔中加入10 μl CCK-8溶液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中孵育4 h。使用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm處的吸光度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染miR-193a-5p mimic后對(duì)CDK14 3’UTR的熒光素酶相對(duì)活性的影響

通過(guò)Targetscan在線工具分析，發(fā)現(xiàn)miR-193a-5p與CDK14的3‘UTR高度匹配，且匹配區(qū)域位于3‘UTR的160-166位置。將匹配區(qū)域做UG突變，發(fā)現(xiàn)miR-193a-5p靶向CDK14的3‘UTR(P<0.05，圖1，表1)

Tab. 1 miR-193a-5p targets CDK14

2.2 過(guò)表達(dá)miR-193a-5p后對(duì)卵巢癌細(xì)胞OVAC的增殖、細(xì)胞活力和EMT的影響

轉(zhuǎn)染miR-193a-5p mimics后，通過(guò)q-PCR檢測(cè)到miR-193a-5p的表達(dá)量增高(P<0.05, 1.03±0.11vs1.78±0.05)。裂解細(xì)胞后，通過(guò)WB檢測(cè)到CDK14的表達(dá)量下降(P<0.05)，EMT相關(guān)蛋白質(zhì)E-cadherin的表達(dá)量上升(P<0.05)，vimentin、fibronectin和N-cadherin的表達(dá)量下降(P<0.05，圖2)。并且，過(guò)表達(dá)miR-193a-5p后，卵巢癌細(xì)胞OVAC的增殖和細(xì)胞活力均增加(P<0.05，表2，表3)。

Fig. 2 Overexpression of miR-193a-5p, WB detects CDK14 and EMT-related protein expression

Tab. 2 CCK-8 detects cell proliferation after overexpression of miR-193a-5p

Tab. 3 The activity of MTT cells after overexpression of miR-193a-5p

2.3 基因沉默miR-193a-5p后對(duì)卵巢癌細(xì)胞OVAC的增殖、細(xì)胞活力和EMT的影響

轉(zhuǎn)染miR-193a-5p inhibitor后，通過(guò)q-PCR檢測(cè)到miR-193a-5p的表達(dá)量下降(P<0.05, 1.04±0.12vs0.32±0.05)。裂解細(xì)胞后，通過(guò)WB檢測(cè)到CDK14的表達(dá)量上升(P<0.05)，EMT相關(guān)蛋白質(zhì)E-cadherin的表達(dá)量下降(P<0.05)，vimentin、fibronectin和N-cadherin的表達(dá)量上升(P<0.05，圖3)。并且，基因沉默miR-193a-5p后，卵巢癌細(xì)胞OVAC的增殖和細(xì)胞活力均下降(P<0.05，表4，表5)。

3 討論

卵巢癌是女性因癌癥而死亡的第四大原因，其整體5年生存率約為30%[10]。由于卵巢癌的早期臨床癥狀不典型，大約70%的患者在診斷時(shí)腫瘤已經(jīng)超出卵巢傳播到盆腔和腹腔器官。盡管近年來(lái)已經(jīng)應(yīng)用了外科手術(shù)和細(xì)胞毒性治療，但卵巢癌的5年生存率仍只有30%。這主要是因?yàn)閷?duì)卵巢癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制了解不夠深入。因此，進(jìn)一步研究促進(jìn)卵巢癌進(jìn)展的分子機(jī)制對(duì)于尋找新的治療方法和改善這種疾病的預(yù)后將是有意義的。

Fig. 3 Detection of CDK14 and EMT-related protein expression by WB after knockdown of miR-193a-5p

Tab. 4 CCK-8 detects cell proliferation after knockdown of miR-193a-5p

Tab. 5 MTT assay for cell viability after knockdown of miR-193a-5p

miRNA是一種微小的非蛋白質(zhì)編碼RNA，通過(guò)與靶mRNA中部分互補(bǔ)的靶位點(diǎn)相互作用，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)。越來(lái)越多的研究者在卵巢癌中進(jìn)行了miRNA表達(dá)譜分析[11]。 例如， miR-106b，miR-143，miR-145，miR-125b等具有致癌功能的miRNA; miR-30，miR-124和miR-199等具有腫瘤抑制作用的miRNA[12-15]。在本研究中，發(fā)現(xiàn)miR-193a-5p靶向CDK14的3‘UTR的160-166位置。過(guò)表達(dá)miR-193a-5p后， CDK14的表達(dá)量下降；但基因沉默miR-193a-5p后， CDK14的表達(dá)量上升。CDK14已被證明在控制細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞增殖中發(fā)揮關(guān)鍵作用[16]。提示miR-193a-5p可能調(diào)控卵巢癌的細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞增殖。

最近，有證據(jù)表明CDK14在幾種惡性腫瘤中表達(dá)增加，例如食道癌，肝細(xì)胞癌，乳腺癌，并參與細(xì)胞周期，腫瘤增殖，侵襲，遷移的調(diào)節(jié)，這進(jìn)一步影響了腫瘤的預(yù)后[17]。在本研究中，miR-193a-5p引起的CDK14表達(dá)降低，導(dǎo)致CDK14的表達(dá)量下降，卵巢癌細(xì)胞OVAC的增殖、細(xì)胞活力和EMT的上升；同時(shí)，基因沉默miR-193a-5p導(dǎo)致CDK14表達(dá)量的上升，造成卵巢癌細(xì)胞OVAC的增殖、細(xì)胞活力和EMT的下降。CDK14參與控制真核細(xì)胞周期，其活性由相關(guān)的細(xì)胞周期蛋白控制。CDK14通過(guò)與CCDN3的相互作用，作為細(xì)胞周期進(jìn)展和細(xì)胞增殖的促進(jìn)因子。因此，miR-193a-5p通過(guò)靶向CDK14的3‘UTR以減少CDK14在mRNA水平上降低，進(jìn)而導(dǎo)致CDK14在蛋白水平上下降，與CCDN3相互作用的CDK14蛋白減少，CCDN3促進(jìn)增殖和細(xì)胞活力的能力降低，最終導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞OVAC的增殖、細(xì)胞活力和EMT的減少?；虺聊珻DK14后能夠抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖，侵襲和遷移并抑制EMT的進(jìn)展[18]。提示miR-193a-5p可能是在多種癌癥中被抑制，如果通過(guò)體外合成miR-193a-5p的注射至患者的癌組織或癌組織被切除的部位可能會(huì)抑制癌癥的復(fù)發(fā)。但是，miR-193a-5p具體的劑量和給予方式需要進(jìn)一步探索。盡管卵巢癌有6種類(lèi)型，但是本研究?jī)H在細(xì)胞水平探討miR-193a-5p的作用機(jī)制，具體miR-193a-5p靶向CDK14的3‘UTR可應(yīng)用于哪一種癌癥仍然需要進(jìn)一步的探索。在上皮性卵巢癌中， CDK14在上皮性卵巢癌細(xì)胞系和上皮性卵巢癌組織中均過(guò)表達(dá)，CDK14表達(dá)水平與腫瘤分級(jí)，淋巴轉(zhuǎn)移以及預(yù)后不良有關(guān)[19]。本研究創(chuàng)新性地報(bào)道了卵巢癌中基于 miR-193a-5p 的CDK14高表達(dá)的潛在機(jī)制，miR-193a-5p成為潛在的靶向治療卵巢癌的miRNA。在體外合成miR-193a-5p后，可通過(guò)藕連某個(gè)特異性識(shí)別卵巢癌的分子靶向進(jìn)入卵巢癌細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)降解CDK14的mRNA來(lái)達(dá)到抑制或治療卵巢癌的目的。因此，本研究豐富了miRNA在卵巢癌發(fā)生發(fā)展的潛在功能，并為小分子RNA治療卵巢癌提供了理論基礎(chǔ)。