杜 洋， 邵淑麗,2△， 焦凱賀， 劉祥露， 馮 元， 張偉偉,2

(1. 齊齊哈爾大學生命科學與農(nóng)林學院， 2. 抗性基因工程與寒地生物多樣性保護黑龍江省重點實驗室， 黑龍江 齊齊哈爾 161006)

目前，胃癌(gastric carcinoma, GC)是致死率極高的惡性腫瘤，嚴重威脅人類健康[1]。胃癌在不同的時期治療的手段也各不相同，但大多的治療方式還是以外科手術(shù)為主，輔以放、化療和藥物治療等綜合治療[2]。盡管伴隨著我國診療科學的高速發(fā)展，但還是有大約90%以上的胃癌患者在接受外科手術(shù)治療后死于術(shù)后復發(fā)[3]。而化療則有一些不同，可以在一定程度上提高患者的生存率，但常規(guī)的化療藥物化療后會出現(xiàn)臨床上的不適癥狀和生物免疫功能降低的情況[4]。因此, 尋找環(huán)保、毒副作用小和治療胃癌效果明顯的藥物成為研究工作的重點。白花蛇舌草最早被記載于《廣西中藥志》中，隸屬于茜草科耳草屬，一年生披散草本植物[5]。白花蛇舌草的化學成分中含有多種抗腫瘤的相關(guān)成分, 而這些成分則主要通過誘導癌細胞凋亡[6]、抑制腫瘤組織血管及淋巴管生成[7]、調(diào)控相關(guān)信號通路[8]、調(diào)節(jié)機體免疫功能[9]、抗氧化[10]等途徑實現(xiàn)對腫瘤細胞的抑制作用。然而關(guān)于白花蛇舌草對人胃癌 MKN-45細胞線粒體膜電位及相關(guān)基因表達的影響尚未見報道。因此, 本實驗運用流式細胞術(shù)、qRT-PCR和Western blot等方法研究不同濃度藥物作用MKN-45細胞48 h后對細胞線粒體膜電位及凋亡相關(guān)基因的影響，為白花蛇舌草的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人胃癌MKN-45細胞購自中國醫(yī)學科學院腫瘤研究所。白花蛇舌草(注射液)購自南通飛宇生物制品有限責任公司，其濃度為 1 g/L。優(yōu)級胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司。RPMI-1640培養(yǎng)基干粉購自Gibico公司。UN1Q-10柱式Trizol總RNA提取試劑盒、全蛋白提取試劑盒購自上海生工生物工程股份有限公司。Cytc、caspase3和caspase9抗體購自北京博奧森生物技術(shù)公司。兔抗、鼠抗二抗購自美國LI-COR公司、Power 2×SYBR real-time PCR premixture試劑盒均購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及藥物配制

MNK-45細胞在含有10%胎牛血清、100 mg/L鏈霉素和1×105U/L青霉素的完全培養(yǎng)液中, 于37℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。白花蛇舌草(注射液)經(jīng)0.22 μm的濾器無菌過濾后, 配置成終濃度為20、30、40 μg/ml的白花蛇舌草，按100 μl每管分裝, 放于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。將人胃癌細胞MNK-45分成4組，每組設(shè)置3個復孔，對照組為含未加入白花蛇舌草的MNK-45細胞；3組實驗組分別加入終濃度為20、30、40 μg/ml白花蛇舌草的MNK-45細胞；各組在5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育48 h后，利用激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化，流式細胞術(shù)檢測線粒體膜電位，qRT-PCR檢測Cytochrome C (Cyt c)、caspase3和caspase9基因的表達變化，Western blot檢測Cytochrome C (Cyt c)、caspase3和caspase9蛋白的表達變化。

1.3 激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞形態(tài)

將爬片放入到6孔板中，接種MNK-45細胞，待細胞生長至對數(shù)生長期, 分別加入終濃度為0、20、30、40 μg/ml的白花蛇舌草, 培養(yǎng)48 h后, 先用1 ml 4%多聚甲醛固定MNK-45細胞，再用濃度為0.5 μg/μl的吖啶橙200 μl在室溫條件下孵育3～5 min, 激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞核變化并拍照。

1.4 流式細胞術(shù)檢測細胞線粒體膜電位

收集終濃度為0、20、30、40 μg/ml的白花蛇舌草處理48 h后的人胃癌MNK-45細胞，并將細胞重懸于500 μl稀釋好的Rho-123染色液中, 2 000 r/min離心5 min，用1xPBS洗兩次后在500 μl 1×PBS中重懸，進行流式細胞儀的上機檢測。

1.5 qRT-PCR檢測mRNA表達

根據(jù)Cytc、caspase3、caspase9和β-actin基因的序列, 用Primer Premier 5設(shè)計PCR引物。Cytc基因上游引物序列(F)為： 5′-CTG GGT GAC GAG TGA AAC TG-3′, 下游引物序列(R)為： 5′-TGA GCA CAA CAG GAA CTG GA-3′, 擴增產(chǎn)物長度為104 bp。caspase3基因上游引物序列(F)為： 5′-GGA ACG AAC GGA CCT GTG-3′, 下游引物序列(R)為： 5′-GCC TCC ACT GGT ATC TTC TG-3′, 擴增產(chǎn)物長度為135 bp。Caspase9基因上游引物序列(F)為： 5′-CCA GAT GCT GTC CCA TAC C-3′, 下游引物序列(R)為： 5′-ATT GGC GAC CCT GAG AAG-3′, 擴增產(chǎn)物長度為228 bp。β-actin基因上游引物序列(F)為： 5′-AGC GAG CAT CCC CCA AAG TT-3′, 下游引物序列(R)為： 5′-GGG CAC GAA GGC TCA TCA TT-3′, 擴增產(chǎn)物長度為205 bp。收集終濃度為0、20、30、40 μg/ml的白花蛇舌草處理48 h的人胃癌MNK-45細胞, 使用Trizol試劑盒提取細胞總RNA, 并將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以該cDNA為模板, β-actin為內(nèi)參, 每組實驗設(shè)有3個重復后，進行qRT-PCR檢測。得到的Ct值采用2-ΔΔCt計算獲得不同藥物濃度組別細胞中Cytc、caspase3和caspase9基因mRNA的相對表達量。

1.6 Western blot檢測蛋白表達

收集終濃度為0、20、30、40 μg/ml的白花蛇舌草處理48 h的人胃癌MNK-45細胞, 用蛋白裂解液裂解細胞提取細胞全蛋白后, 將蛋白煮沸變性進行SDS-PAGE凝膠電泳, 然后電轉(zhuǎn)移到NC膜上，使用脫脂奶粉和PBS的混合封閉液封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，PBST洗后二抗孵育1 h，再用PBST洗后上機進行掃描檢測。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 白花蛇舌草對人胃癌 MKN-45細胞形態(tài)的影響

結(jié)果表明，0濃度組細胞大小均一，細胞核清晰且體積較大，呈正圓形，并有完整的細胞膜包被。與0濃度組相比，20、30、40 μg/ml白花蛇舌草處理組隨著白花蛇舌草濃度的不斷升高細胞大小不在均一并伴隨體積縮小的現(xiàn)象，細胞形態(tài)變?yōu)椴灰?guī)則狀態(tài)，細胞膜皺縮，細胞內(nèi)的染色質(zhì)高度聚集呈現(xiàn)邊緣化，視野下細胞數(shù)明顯減少，出現(xiàn)細胞碎片甚至破裂現(xiàn)象，出現(xiàn)明顯的凋亡小體(圖1)。

Fig. 1 The cell morphology of human gastric cancer MNK-45 cells treat with Hedyotis diffusa for 48 h under confocal microscopy (acridine orange, Bar=10 μm)

2.2 白花蛇舌草對人胃癌 MKN-45細胞線粒體膜電位的影響

結(jié)果表明，0濃度組細胞的線粒體膜電位為 96.4±1.96，而在終濃度為20、30、40 μg/ml的白花蛇舌草處理下細胞的線粒體膜電位分別為90.9±1.67、73.0±1.16和17.4±0.81，與0濃度組相比均有不同程度的降低(P<0.05,P<0.01，圖2，表1)。

Fig. 2 Detection of mitochondrial membrane potential of human gastric cancer MNK-45 cells treated with hedyotis diffusa for 48 h (n= 3)

Tab. 1 Detection of mitochondrial membrane potential and Cyt c, caspase3 and caspase9 mRNA expressions in MNK-45 cells n=3)

2.3 白花蛇舌草對人胃癌 MKN-45細胞Cyt c、caspase3和caspase9基因mRNA的影響

結(jié)果表明，與0濃度組相比，隨著白花蛇舌草藥物濃度的升高，Cytc、caspase3和caspase9基因mRNA的表達均有不同程度的升高(P<0.01，表1)。

2.4 白花蛇舌草對人胃癌 MKN-45細胞Cyt c、caspase3和caspase9蛋白表達的影響

結(jié)果發(fā)現(xiàn),與0濃度組相比，隨著白花蛇舌草藥物濃度的升高，Cyt c、caspase3和caspase9蛋白表達升高，由于caspase3和caspase9蛋白發(fā)揮作用的形式是剪接激活，因此伴隨著蛋白剪接體的從無到有線粒體途徑的凋亡現(xiàn)象也逐漸明顯，caspase3的蛋白剪接體cleaved-caspase3和caspase9的蛋白剪接體cleaved-caspase9蛋白的含量升高(P<0.05,P<0.01，圖3，表2)。

Tab. 2 The effects of Hedyotis diffusa on protein levels of Cyt c、caspase3 and caspase9 n=3)

Fig. 3 The effects of hedyotis diffusa on protein levels of Cyt c、caspase3 and caspase9 ( n= 3)

3 討論

胃癌是全球性的惡性疾病且發(fā)病率居高不下。目前為止，化療是現(xiàn)階段最有成效的治療手段之一，但現(xiàn)有的化療藥物大多都有較大的毒副作用，而白花蛇舌草作為一種天然中藥，其毒副作用明顯小于化學合成的藥物，且在抗腫瘤方面顯示良好的藥理活性[5,6]。曾珠等人也發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草能夠抑制肺癌干細胞的增殖, 促進其凋亡, 使細胞被阻滯于G1期[11]。李等人也發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草能夠抑制結(jié)腸癌細胞的轉(zhuǎn)移, 抑制其淋巴管形成, 使VEGF-C的表達下降[12]。本研究中顯示，白花蛇舌草可以誘導胃癌細胞的凋亡，經(jīng)過20、30、40 μg/ml的白花蛇舌草孵育48 h后，人胃癌MNK-45細胞數(shù)量明顯低于對照組，凋亡現(xiàn)象明顯，在終濃度為40 μg/ml時對MNK-45細胞凋亡的誘導最為明顯。

細胞凋亡則是機體自身使細胞程序性死亡的生理過程，其存在著死亡受體[13]、線粒體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路[14]三條通路，其中線粒體通路在細胞凋亡過程中起著重要作用，是細胞凋亡的主要途徑之一[15,16]。李鳳巖等人發(fā)現(xiàn)甘草次酸可以促進甲狀腺癌細胞SW579的凋亡[17]。洪凱等人的研究發(fā)現(xiàn)2-12烷基-6-甲氧基環(huán)己基-2,5-二烯-1,4-二酮能激活OCI-LY19細胞線粒體凋亡的內(nèi)源性通路而促進彌漫大B淋巴瘤細胞凋亡，抑制OCI-LY19細胞增殖，具有抗彌漫大B淋巴瘤的作用[18]。線粒體凋亡機制是通過改變線粒體膜的通透性，將細胞色素C等凋亡蛋白釋放到細胞質(zhì)中，此后，細胞色素C與凋亡酶激活因子1(Apaf-1)和caspase9形成凋亡體，caspase9自我剪切活化，然后在ATP等存在下將無活性的caspase3酶原剪切激活，從而引起細胞凋亡[19]。在本研究中，20、30、40 μg/ml的白花蛇舌草均可以降低MNK-45細胞線粒體膜電位，并使凋亡相關(guān)基因Cytc、caspase3和caspase9基因的表達顯著升高，且caspase3的蛋白剪接體cleaved-caspase3和caspase9的蛋白剪接體cleaved-caspase9蛋白的含量升高。其中在白花蛇舌草的終濃度達到40 μg/ml時線粒體膜電位降低至最低，Cytc、caspase3和caspase9基因的表達升至最高。提示白花蛇舌草刺激人胃癌MNK-45細胞后可能通過引起線粒體膜通透性改變，降低線粒體膜電位，釋放Cyt c，促發(fā)caspase細胞凋亡級聯(lián)反應，caspase-3凋亡途徑被激活并參與白花蛇舌草誘導的人胃癌MNK-45細胞凋亡機制。由于藥物對人胃癌MNK-45細胞蛋白質(zhì)的表達需要一定周期，基因表達的改變一般發(fā)生在給藥的24 h后，但是出現(xiàn)蛋白質(zhì)改變一般要晚于基因表達，因此本實驗在48 h對目的蛋白進行檢測。這與蔣顯發(fā)現(xiàn)的藥物可誘使線粒體釋放凋亡因子使線粒體膜電位降低促使細胞凋亡的結(jié)果一致[20]。

綜上所述，白花蛇舌草能夠使人胃癌MNK-45細胞線粒體膜電位降低，上調(diào)Cytc、caspase3和caspase9基因表達，誘導細胞凋亡，進而發(fā)揮抗胃癌的作用。白花蛇舌草較為常見，價格低廉，本研究結(jié)果可為其在腫瘤臨床治療中研發(fā)應用提供實驗依據(jù)。