王順民 楊曉丹 曾勇

[摘要] 目的 探討利血平與大鼠主動脈血管平滑肌細胞（RA-VSMC）自噬的關系。 方法 用含利血平或者厄爾平衡鹽緩沖液（EBSS）培養(yǎng)基體外培養(yǎng)RA-VSMC，MTT法檢測對照組、5 μmol/L利血平組、10 μmol/L利血平組、20 μmol/L利血平組、50 μmol/L利血平組RA-VSMC的細胞活力;mRFP-GFP-LC3雙熒光體系示蹤RA-VSMC的自噬小體;實時熒光定量PCR（qPCR）以及蛋白免疫印跡（WB）實驗檢測對照組、10 μmol/L利血平組、50 μmol/L利血平組和EBSS組RA-VSMC自噬相關基因LC3和Beclin1的表達。 結果 MTT結果顯示，與對照組比較，5 μmol/L利血平組、10 μmol/L利血平組、20 μmol/L利血平組和50 μmol/L利血平組細胞活力均顯著降低（P < 0.05或P < 0.01）;mRFP-GFP-LC3雙熒光體系結果顯示，對照組和10 μmol/L利血平組細胞中無明顯自噬小體，50 μmol/L利血平組和EBSS組細胞形成明顯自噬小體;qPCR結果顯示，與對照組比較，10 μmol/L利血平組LC3 mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），50 μmol/L利血平組和EBSS組LC3 mRNA表達水平顯著升高（P < 0.05或P < 0.01）;10 μmol/L利血平組、50 μmol/L利血平組和EBSS組Beclin1 mRNA表達水平顯著升高（P < 0.01）;WB結果顯示，與對照組比較，10 μmol/L利血平組、50 μmol/L利血平組和EBSS組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率顯著升高（P < 0.01），10 μmol/L利血平組、50 μmol/L利血平組和EBSS組Beclin1蛋白表達水平顯著升高（P < 0.01）。 結論 利血平可能通過自噬機制調控VSMC的增殖。

[關鍵詞] 利血平;血管平滑肌細胞;增殖;自噬

[中圖分類號] R692.31 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2020）06（a）-0004-04

[Abstract] Objective To explore the relationship of Reserpine and the autophagy of rat aortic vascular smooth muscle cells （RA-VSMC）. Methods RA-VSMC was cultured in medium with Reserpine or Earles balanced salt solution （EBSS） in vitro. MTT assay was used to detect the effect of Reserpine on the proliferation of RA-VSMC with 5 μmol/L Reserpine， 10 μmol/L Reserpine， 20 μmol/L Reserpine and 50 μmol/L Reserpine. The dual-fluorescence mRFP-GFP-LC3 was used to trace the autophagosomes of RA-VSMC. Real-time fluorescence quantitative PCR （qPCR） and Western blot （WB） were used to detect the expression of LC3 and Beclin1. Results The MTT results showed that compared with the control group， the cell viability in the 5 μmol/L Reserpine group， 10 μmol/L Reserpine group， 20 μmol/L Reserpine group and 50 μmol/L Reserpine group were significantly reduced （P < 0.05 or P < 0.01）. The results of the dual-fluorescence mRFP-GFP-LC3 showed that there were no significant autophagosomes in the cells of the control group and the 10 μmol/L Reserpine group， and the 50 μmol/L Reserpine group and EBSS group formed significant autophagosomes. qPCR results showed that compared with the control group， there was no significant difference in LC3 mRNA expression level in the 10 μmol/L Reserpine group and the control group （P > 0.05）. LC3 mRNA expression levels in 50 μmol/L Reserpine group and EBSS group increased significantly （P < 0.05 or P < 0.01）. Beclin1 mRNA expression levels was significantly increased in 10 μmol/L Reserpine group， 50 μmol/L Reserpine group and EBSS group （P < 0.01）. WB results showed that， compared with the control group， the 10 μmol/L Reserpine group， 50 μmol/L Reserpine group and EBSS group LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ ratio increased significantly （P < 0.01）， Beclin1 protein expression was significantly increased in 10 μmol/L Reserpine group， 50 μmol/L Reserpine group and EBSS group （P < 0.01）. Conclusion Reserpine may regulate the proliferation of vascular smooth muscle cells through autophagy.

[Key words] Reserpine; Vascular smooth muscle cells; Proliferation; Autophagy

血管平滑肌細胞（VSMC）是構成血管壁組織結構及維持血管張力的主要細胞成分，通過緩慢的輕度收縮以維持血管壁的張力[1]。VSMC的異常增殖、凋亡、纖維沉積等病理改變，引起血管壁增厚、管腔變窄和血管壁結構改變，最終導致血壓增加[2-3]。自噬被稱為Ⅱ型程序性細胞死亡，是一種進化保守的分解代謝途徑[4]。利血平是一類從蘿芙木屬多種植物中提出的吲哚型生物堿[5]，常用于治療高血壓[6]和精神分裂癥[7]。本研究利用利血平干預大鼠主動脈血管平滑肌細胞（RA-VSMC），觀察RA-VSMC自噬現象，為臨床上利血平治療高血壓提供新的實驗支持。

1 材料與方法

1.1材料

原代大鼠主動脈平滑肌細胞（RA-VSMC），利血平（MCE，貨號：27769）。

1.2 儀器

電子天平（RADWAG，AS 310.R2，310 g×0.1 mg）;倒置熒光顯微鏡（OLYMPUS，CKX53）;多功能酶標儀（PE，VICTOR NIVO）;化學發(fā)光成像系統(tǒng)（上海天能，5200 Multi）;定量PCR儀（Analytik jena，qTower 3.2G）

1.3 試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基（Gibco，貨號：8118099）;胎牛血清（Gibco，貨號：42F3575K）;厄爾平衡鹽緩沖液（EBSS）（Procell，貨號：PM17JAN009）;MTT（Sigma）;Anti-LC3（proteintech，貨號：00062683）;Anti-Beclin 1（proteintech，貨號：00057705）;Anti-β-actin（proteintech，貨號：10004413）;Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）HRP（聯(lián)科，貨號：A90534）;BeyoFast SYBR Green qPCR Mix（2×）（Beyotime，貨號：071219191022）。

1.4 細胞培養(yǎng)

RA-VSMC細胞培養(yǎng)于含1%雙抗和10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中，將細胞培養(yǎng)在37℃，5%CO2的無菌培養(yǎng)箱中。

1.5 MTT法檢測細胞增殖

RA-VSMC以1×105個/mL的比例接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)至90%以上的細胞貼壁。設置5個分組：對照組、5 μmol/L利血平組、10 μmol/L利血平組、20 μmol/L利血平組、50 μmol/L利血平組。各組細胞更換為對應培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，更換新鮮培養(yǎng)基，加入10 μL MTT（0.5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。移除培養(yǎng)基，添加DMSO，搖床輕搖15 min，酶標儀下測定波長492 nm處OD值。

1.6 雙熒光體系觀察自噬小體

RA-VSMC細胞以1×105個/mL的比例接種于6孔板中，待細胞密度達到80%后，將mRFP-eGFP-LC3質粒[8]轉染細胞，6 h后更換為完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。設置4個分組：對照組、10 μmol/L利血平組、50 μmol/L利血平組和EBSS組。各組細胞更換為對應培養(yǎng)基或EBSS溶液，繼續(xù)培養(yǎng)6 h。去除培養(yǎng)基，4%多聚甲醛溶液固定細胞10 min，DAPI染核。熒光顯微鏡下觀察細胞內綠色和紅色LC3的亮點（自噬體）的數量。

1.7 實時熒光定量PCR（qPCR）檢測LC3和Beclin1 mRNA的表達

RA-VSMC細胞以1×105個/mL的比例接種于6孔板中，培養(yǎng)48 h。細胞分組同“1.6”。各組細胞更換對應培養(yǎng)基或EBSS溶液，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，收集細胞。采用Trizol法提取細胞總RNA，并反轉錄為cDNA。采用qPCR法檢測LC3和Beclin1 mRNA的表達，反應體系為20 μL。使用Primer Premier 5.0進行引物設計，引物序列由上海生工生物公司合成。引物序列見表1。

1.8 蛋白免疫印跡實驗檢測LC3和Beclin-1蛋白的表達

細胞培養(yǎng)及分組同“1.6”。采用RIPA裂解液提取細胞總蛋白。蛋白經SDS-PAGE電泳后，轉至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，一抗4℃孵育過夜（LC3 1∶1000;Beclin1 1∶1500;β-actin 1∶3000）。相應標記HRP的辣根過氧化物酶標記二抗室溫孵育1 h，使用化學發(fā)光液進行顯色。使用Image J軟件測定吸光度，計算蛋白相對表達量。

1.9 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗或采用單因素方差分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度利血平對RA-VSMC活力的影響

MTT結果顯示，與對照組比較，5 μmol/L利血平組、10 μmol/L利血平組、20 μmol/L利血平組和50 μmol/L利血平組細胞活力均顯著降低（P < 0.05或P < 0.01）。見圖1。

2.2 不同濃度利血平對RA-VSMC自噬的影響

雙熒光體系觀察RA-VSMC中綠色和紅色LC3-Ⅱ顆粒（自噬體），結果顯示，對照組和10 μmol/L利血平組細胞中無明顯自噬小體，50 μmol/L利血平組和EBSS組細胞形成明顯自噬小體，最右側一列為左側選中區(qū)域放大后結果。見圖2（封三）。

2.3 不同濃度利血平對自噬相關基因表達的影響

與對照組比較，10 μmol/L利血平組LC3 mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），50 μmol/L利血平組LC3 mRNA表達水平顯著升高（P < 0.05），EBSS組LC3 mRNA表達水平顯著升高（P < 0.01）;10 μmol/L利血平組、50 μmol/L利血平組和EBSS組Beclin1 mRNA表達顯著升高（P < 0.01）。見圖3。

2.4不同濃度利血平對自噬相關蛋白表達的影響

與對照組比較，10 μmol/L利血平組、50 μmol/L利血平組和EBSS組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率顯著升高（P < 0.01）;10 μmol/L利血平組、50 μmol/L利血平組和EBSS組Beclin1蛋白表達顯著升高（P < 0.01）。見圖4～5。

3 討論

高血壓作為一種最常見的慢性病，是心腦血管疾病最主要的危險因素，例如心肌梗死、腦梗死、慢性腎臟疾病等[9]。利血平是一類廣泛用于輕度和中度高血壓治療的藥物，同時還可用于治療精神分裂。一般認為，利血平通過抑制交感神經末梢囊泡中神經遞質的合成和貯存，妨礙交感神經沖動，導致血管擴張，血壓下降。最新研究顯示[10]，利血平可通過誘導自噬小體導致神經細胞死亡，提示參與神經細胞自噬可能是利血平治療神經退行性疾病的一種方式。作為血管的主要組成部分，VSMC的異常增殖會引起血管結構的改變，導致血壓升高[11]。因此本研究探討了利血平是否參與體外培養(yǎng)大鼠主動脈VSMC的自噬。

自噬現象是一種十分保守的細胞行為，在維護細胞內穩(wěn)態(tài)方面起重要作用[12-13]，自噬調控的失調與多種疾病相關[14-16]。當細胞發(fā)生自噬后，LC3前體被ATG4剪切變成LC3-Ⅰ，隨后LC3-Ⅰ在ATG7和ATG3的作用下，經過一系列反應，生成LC3-Ⅱ，LC-Ⅱ/LC3-Ⅰ顯示了自噬水平的高低[17]。Beclin1是細胞自噬的關鍵起始蛋白，主要與PI3K形成復合物，調節(jié)ATG蛋白在自噬前體中的定位[18-19]。本研究通過mRFP-GFP-LC3雙熒光體系示蹤自噬小體，通過免蛋白疫印跡實驗檢測了LC3-II/LC3-Ⅰ和Beclin1的表達，確認利血平可誘導主動脈平滑肌細胞產生自噬。已有研究顯示[20-21]自噬與VSMC的凋亡、增殖、遷移、基質分泌、收縮/舒張和分化等存在重要聯(lián)系;自噬直接影響著VSMC的生存與功能，并與血管疾病的發(fā)生發(fā)展也有密切聯(lián)系。自噬功能的缺陷或不足將導致動脈粥樣硬化和血管變窄。本研究結果顯示，誘導VMSC自噬可能是利血平發(fā)揮降低血壓功能的另一種方式。

綜上所述，本研究提示利血平對RA-VSMC具有一定的抑制作用，并誘導細胞產生自噬作用，均呈現濃度依賴性。因此，筆者推測利血平可直接作用于VSMC，并可能通過抑制VSMC的增殖達到降壓的效果。本研究揭示利血平在高血壓治療上的新靶點，為新藥開發(fā)及高血壓治療提供新的思路和理論依據。

[參考文獻]

[1] ?Feil S，Fehrenbacher B，Lukowski R，et al. Transdifferentiation of vascular smooth muscle cells to macrophage-like cells during atherogenesis [J]. Circ Res，2014，115（7）：662-667.

[2] ?Yang J，Li X，Al-Lamki RS，et al. Sildenafil potentiates bone morphogenetic protein signaling in pulmonary arterial smooth muscle cells and in experimental pulmonary hypertension [J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2013，33（1）：34-42.

[3] ?Jaminon A，Reesink K，Kroon A，et al. The Role of Vascular Smooth Muscle Cells in Arterial Remodeling： Focus on Calcification-Related Processes [J]. Int J Mol Sci，2019，20（22）.pii：E5694.

[4] ?Saha S，Panigrahi DP，Patil S，et al. Autophagy in health and disease： A comprehensive review [J]. Biomed Pharmacother，2018，104：485-495.

[5] ?Leao AH，Sarmento-Silva AJ，Santos JR，et al. Molecular，Neurochemical，and Behavioral Hallmarks of Reserpine as a Model for Parkinson′s Disease：New Perspectives to a Long-Standing Model [J]. Brain Pathol，2015，25（4）：377-390.

[6] ?王奧昉.纈沙坦與利血平治療高血壓的療效研究[J].中國地方病防治雜志，2017，32（4）：440.

[7] ?王夏青.5-羥色胺2C受體激動劑抗精神分裂癥作用的潛在機制[D].重慶：西南大學，2018.

[8] ?黃楨鈞，劉彬，劉本榮，等.雙熒光mRFP-eGFP-LC3體系在細胞自噬中的作用[J].貴陽醫(yī)學院學報，2015，40（10）：1029-1032.

[9] ?Shi W，Zhou Y，Wang H，et al. Synergistic interaction of hypertension and hyperhomocysteinemia on chronic kidney disease：Findings from the National Health and Nutrition Examination Survey 1999-2006 [J]. J Clin Hypertens （Greenwich），2019，21（10）：1567-1577.

[10] ?Lee KI，Kim MJ，Koh H，et al. The anti-hypertensive drug reserpine induces neuronal cell death through inhibition of autophagic flux [J]. Biochem Biophys Res Commun，2015，462（4）：402-408.

[11] ?蔡美麗，徐健飛.高血壓與心血管重構相關關系的研究進展[J].現代醫(yī)學與健康研究電子雜志，2018，2（8）：131，137.

[12] ?Smith M，Wilkinson S. ER homeostasis and autophagy [J]. Essays Biochem，2017，61（6）：625-635.

[13] ?Cadwell K. Crosstalk between autophagy and inflammatory signalling pathways：balancing defence and homeostasis [J]. Nat Rev Immunol，2016，16（11）：661-675.

[14] ?Um JH，Yun J. Emerging role of mitophagy in human diseases and physiology [J]. BMB Rep，2017，50（6）：299-307.

[15] ?Rybstein MD，Bravo-San pedro JM，Kroemer G，et al. The autophagic network and cancer [J]. Nat Cell Biol，2018，20（3）：243-251.

[16] ?Ma Y，Galluzzi L，Zitvogel L，et al. Autophagy and cellular immune responses [J]. Immunity，2013，39（2）：211-27.

[17] ?Liu C，Xu P，Chen D，et al. Roles of autophagy-related genes Beclin-1 and LC3 in the development and progression of prostate cancer and benign prostatic hyperplasia [J]. Biomed Rep，2013，1（6）：855-860.

[18] ?Xu F，Fang Y，Yan L，et al. Nuclear localization of Beclin 1 promotes radiation-induced DNA damage repair independent of autophagy [J]. Sci Rep，2017，7：45385.

[19] ?Wang RC，Wei Y，An Z，et al. Akt-mediated regulation of autophagy and tumorigenesis through Beclin 1 phosphorylation [J]. Science，2012，338（6109）：956-959.

[20] ?Tai S，Hu XQ，Peng DQ，et al. The roles of autophagy in vascular smooth muscle cells [J]. Int J Cardiol，2016， 211：1-6.

[21] ?Ibrahim YF，Shults NV，Rybka V，et al. Docetaxel Reverses Pulmonary Vascular Remodeling by Decreasing Autophagy and Resolves Right Ventricular Fibrosis [J]. J Pharmacol Exp Ther，2017，363（1）：20-34.

（收稿日期：2019-10-17 ?本文編輯：劉永巧）