趙琳 肖瑩 李文娟 張維丹 白楓

(遼寧省人民醫(yī)院婦科，遼寧 沈陽(yáng) 110000)

藥物流產(chǎn)后的異常子宮出血，往往與患者子宮內(nèi)膜血管以及蛋白表達(dá)水平有關(guān)，積極進(jìn)行藥物流產(chǎn)后患者子宮內(nèi)膜變化有利于預(yù)防藥物流產(chǎn)后異常的子宮出血以及大出血等[1-3]。白細(xì)胞分化抗原簇34(CD34)是血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物，在血管的新生、重鑄以及成熟過(guò)程中具有重要作用[4]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是一種血管內(nèi)皮細(xì)胞多功能因子，可增加血管通透性，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、分裂、增生，誘導(dǎo)血管生成。人凝血因子Ⅷ相關(guān)抗原(Ⅷ-RAg)是廣泛存在于內(nèi)皮細(xì)胞中的一種糖蛋白，是新生血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物，反應(yīng)血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附狀態(tài)，參與血管形成過(guò)程[5]。本文主要探討宮內(nèi)絨毛組織中CD34、VEGF、Ⅷ-RAg的不同表達(dá)與藥物流產(chǎn)術(shù)后異常子宮出血的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象 選取本院2016年4月至2019年1月本院就診行米非司酮藥物流產(chǎn)的早孕婦女80例作為藥物流產(chǎn)組，另選擇同期采用手術(shù)流產(chǎn)的方式終止妊娠的早孕婦女30例作為對(duì)照組，兩組均收集孕囊排出后或手術(shù)完成后的宮內(nèi)絨毛組織。藥物流產(chǎn)組年齡18～34歲，平均(26.93±4.30)歲；停經(jīng)天數(shù)34～48 d，平均(42.80±5.61)d；孕囊直徑0.7～2.4 cm，平均(1.43±0.32)cm；孕次1～4次，平均(1.83±0.45)次；產(chǎn)次0～3次，平均(0.94±0.14)次；子宮位置：前傾前屈位34例，水平位25例，后傾后屈位21例。對(duì)照組年齡19～35歲，平均(27.25±4.98)歲；停經(jīng)天數(shù)34～49 d，平均(42.79±5.56)d；孕囊直徑0.8～2.4 cm，平均(1.45±0.39)cm；孕次1～4次，平均(1.89±0.36)次；產(chǎn)次0～4次，平均(0.98±0.12)次；子宮位置：前傾前屈位12例，水平位10例，后傾后屈位8例。納入對(duì)象的月經(jīng)周期均規(guī)則，在28～33 d之間；停經(jīng)天數(shù)≤49 d；通過(guò)血β-hCG、尿HCG以及B超檢查，經(jīng)臨床證實(shí)已妊娠；流產(chǎn)前無(wú)陰道出血與難免流產(chǎn)癥狀。已排除血、尿、白帶檢測(cè)異常；1年內(nèi)放置過(guò)宮內(nèi)節(jié)育器；近3個(gè)月內(nèi)服用過(guò)避孕藥或其他激素藥物；合并凝血功能障礙；合并全身性疾病。兩組患者一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2儀器與試劑 鼠抗人CD34單克隆抗體、鼠抗人VEGF單克隆抗體、鼠抗人Ⅷ-R Ag單克隆抗體均來(lái)自美國(guó)Santz Cruz公司。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)、鏈霉菌抗生物素蛋白—過(guò)氧化物酶連結(jié)(SP)試劑盒來(lái)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3檢測(cè)方法 所有標(biāo)本進(jìn)行切片(4 μm)，于60℃溫度下烘烤處理20 min，二甲苯脫蠟，梯度酒精連續(xù)脫水，采用PBS清洗3次，并使用去離子水沖洗，3%H2O2室溫條件下10 min阻斷處理，使用PBS清洗3次，進(jìn)行抗原熱修復(fù)，再次以PBS清洗3次。將標(biāo)本浸泡于10%的BSA中，室溫下孵育5 min，封閉非特異性位點(diǎn)，滴加一抗，4℃下孵育過(guò)夜，使用PBS清洗3次。滴加SP，37℃下孵育30 min，使用PBS清洗3，DAB顯色10 min，使用PBS清洗3次，蘇木素溶液復(fù)染，鹽酸分化，脫水處理10 min，封片，鏡下觀察。

1.4染色結(jié)果判斷 由2名病理科醫(yī)生對(duì)標(biāo)本進(jìn)行觀察。染色強(qiáng)度以平均光密度(OD)表示，OD=各點(diǎn)光密度累積值/有效目標(biāo)分布區(qū)域的面積。切片拍照采用日本Olympus BX-53光鏡，放大倍率為×400，每張切片選擇5個(gè)不連續(xù)視野拍照，條件參照?qǐng)D片分析軟件要求，5個(gè)視野的平均值即為切片光密度結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1宮內(nèi)絨毛組織中CD34、VEGF、Ⅷ-RAg的表達(dá) 藥物流產(chǎn)組CD34、VEGF蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組，Ⅷ-RAg蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組(t=4.646、5.890、6.698，P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 宮內(nèi)絨毛組織中CD34、VEGF、Ⅷ-RAg的表達(dá)

2.2CD34、VEGF、Ⅷ-RAg蛋白表達(dá)相關(guān)性分析 CD34與VEGF蛋白表達(dá)水平呈現(xiàn)正相關(guān)，與Ⅷ-RAg蛋白表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)(r=0.578，-0.468,P<0.05)；VEGF蛋白表達(dá)水平與Ⅷ-RAg呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)(r=-0.505,P<0.05)。

2.3單因素分析 藥物成功組與藥物出血組婚姻狀況比較(P>0.05)；藥物成功組患者年齡、孕囊直徑小于藥物出血組，孕次、產(chǎn)次少于藥物出血組(P<0.05)；兩組慢性盆腔炎、哺乳期早孕、瘢痕子宮、子宮位置狀態(tài)比較(P<0.05)；藥物成功組CD34、VEGF蛋白表達(dá)水平低于藥物出血組，Ⅷ-R Ag蛋白表達(dá)水平高于藥物出血組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 藥物成功組與藥物出血組一般資料分析比較

2.2Logistic回歸分析 Logisitic回歸分析顯示，年齡、慢性盆腔炎、哺乳期早孕、瘢痕子宮、子宮位置、孕次、產(chǎn)次、孕囊直徑、CD34蛋白表達(dá)、VEGF蛋白表達(dá)、Ⅷ-RAg蛋白表達(dá)是藥物流產(chǎn)效果的影響因素。見(jiàn)表3。

表3 藥物流產(chǎn)術(shù)后出血影響Logistic回歸分析

3 討 論

米非司酮作為一種抗孕激素的藥物，其靶結(jié)合位點(diǎn)為孕激素受體，米非司酮抗早孕機(jī)制為使高濃度孕激素蛻膜變性、壞死，導(dǎo)致絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞的變性，進(jìn)一步造成胚胎死亡，終止妊娠。然而臨床應(yīng)用過(guò)程中發(fā)現(xiàn)藥物流產(chǎn)由于陰道出血時(shí)間較長(zhǎng)，易導(dǎo)致一系列并發(fā)癥例如感染引起的不孕等，存在一定的弊端。

VEGF是一種同源二聚體糖蛋白物質(zhì)，由兩條單鏈以二硫鍵鏈接而成，其作為血管內(nèi)皮細(xì)胞中特異性肝素結(jié)合生長(zhǎng)細(xì)胞因子，與體內(nèi)血管誘導(dǎo)新生有關(guān)[6-7]。CD34是一種高特異性血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物，可通過(guò)特異性抗體與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，直接反映體內(nèi)微血管狀態(tài)[8]。本研究中藥物流產(chǎn)組CD34、VEGF蛋白表達(dá)水平均高于人工流產(chǎn)患組。研究[9-10]表明，VEGF的mRNA由剪切方式衍生出了VEGF121、145、165、185、206等蛋白亞型，其中VEGF121、145、165是可溶性蛋白，可直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，增加血管通透性。VEGF表達(dá)水平的提高，可進(jìn)一步造成子宮血管異常增殖，增加子宮異常出血風(fēng)險(xiǎn)。CD34具黏附作用，CD34的存在使得正常內(nèi)皮細(xì)胞具有較強(qiáng)的黏著力，可承受血流壓力，藥物流產(chǎn)后CD34明顯減少，內(nèi)皮細(xì)胞黏著力降低，使得血管容易斷裂，導(dǎo)致出血。本研究進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)CD34蛋白表達(dá)、VEGF蛋白表達(dá)是藥物流產(chǎn)效果的影響因素。

Ⅷ因子由內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，以Ⅷ-RAg以及和ⅧC兩種形式存在。Ⅷ-RAg廣泛存在于內(nèi)皮細(xì)胞表面，是一種糖蛋白，為新生血管內(nèi)皮特異性標(biāo)記物，通常于小的毛細(xì)血管或尚未形成管腔的分支中表達(dá)，參與血管形成過(guò)程，同時(shí)也是反映血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附狀態(tài)的標(biāo)志物之一。VEGF通過(guò)上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞Ⅷ因子的表達(dá)，影響血管的生成或衰退；Ⅷ-RAg的減少可導(dǎo)致內(nèi)膜微血管的形成減少，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)不良，出現(xiàn)不規(guī)則出血[11-12]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組織化染色方法對(duì)Ⅷ-RAg進(jìn)行標(biāo)記，結(jié)果顯示藥物流產(chǎn)組Ⅷ-RAg蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組，提示藥物流產(chǎn)可導(dǎo)致內(nèi)膜血管形成不良。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Ⅷ-RAg蛋白表達(dá)降低是導(dǎo)致藥物流產(chǎn)術(shù)后出血的危險(xiǎn)因素。米非司酮通過(guò)調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)，影響內(nèi)膜的增殖和血管的生成，改變局部微環(huán)境，引起局部Ⅷ-RAg明顯減少，血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘著力降低，導(dǎo)致微血管障礙，造成術(shù)后出血。另外，本研究Logisitic回歸分析顯示年齡、慢性盆腔炎、哺乳期早孕、瘢痕子宮、子宮位置、孕次、產(chǎn)次、孕囊直徑也是藥物流產(chǎn)效果的影響因素。提示在使用藥物流產(chǎn)時(shí)，臨床醫(yī)生應(yīng)嚴(yán)格掌握適應(yīng)證與禁忌證，對(duì)高危早孕婦女及時(shí)采取應(yīng)對(duì)措施，保障治療的安全與有效。

綜上所述，藥物流產(chǎn)術(shù)后宮內(nèi)絨毛組織中CD34、VEGF蛋白表達(dá)增加，Ⅷ-RAg表達(dá)降低，且CD34蛋白表達(dá)、VEGF蛋白表達(dá)、Ⅷ-RAg蛋白表達(dá)是藥物流產(chǎn)效果的影響因素。