崔亞敏，田曉平，趙巧輝，李桂林

鄭州伊美諾生物技術(shù)有限公司，河南 鄭州 450016

巨細(xì)胞病毒 (Cytomegalovirus，CMV) 是一種常見的人類病毒病原體，屬β皰疹病毒亞科。巨細(xì)胞病毒感染可導(dǎo)致嚴(yán)重后果，它會使得免疫力低的孕婦容易感染這類病毒，并導(dǎo)致胎兒流產(chǎn)、死胎、先天殘障[1-3]。據(jù)統(tǒng)計，妊娠期巨細(xì)胞病毒活動性感染是導(dǎo)致嬰兒出生缺陷和發(fā)育障礙的主要病毒原因。因此，巨細(xì)胞病毒-免疫球蛋白 M(Cytomegalovirus-immunoglobulin M，CMV-IgM)對于孕期及新生兒原發(fā)性感染和非原發(fā)性感染(再激活或再感染) 的檢測十分必要[4]。目前對CMV-IgM的檢測主要是通過酶聯(lián)免疫吸附試驗，由于其操作簡單、快速和設(shè)備要求低等原因，成為最常用的診斷方法之一。CMV-IgM作為陽性質(zhì)控品在體外診斷中有著重要作用[5]。而當(dāng)前，陽性對照品 CMV-IgM 大多以收集的高值大樣血漿配制得到，由于臨床高值較難收集導(dǎo)致陽性資源匱乏，無法進(jìn)行大規(guī)模制備。

中國倉鼠卵巢細(xì)胞 (Chinese hamster ovary,CHO) 細(xì)胞是目前最常用、工業(yè)化生產(chǎn)最成功的哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)[6]。CHO細(xì)胞表達(dá)的最大優(yōu)點在于表達(dá)的外源蛋白質(zhì)經(jīng)過一系列的加工修飾，與天然的蛋白質(zhì)分子非常接近。然而，由于哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)培養(yǎng)復(fù)雜、耗時、成本昂貴且IgM亞型抗體作為多聚體表達(dá)量較低[4]，因此，如何提高產(chǎn)量以降低生產(chǎn)成本成為諸多研究者們的研究重點。

分泌表達(dá)是 CHO細(xì)胞表達(dá)基因工程重組蛋白的主要途徑，在外源基因轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到瓶頸時，提高細(xì)胞分泌能力明顯有助于重組蛋白表達(dá)量的提升。CHO細(xì)胞表達(dá)外源蛋白質(zhì)過程中，mRNA翻譯形成的蛋白質(zhì)前體N端的信號肽與信號肽識別因子結(jié)合，在信號肽識別因子的幫助下進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行下一步的修飾，合適的信號肽有助于重組蛋白表達(dá)量的提高[7-10]。

本研究在已報道的基礎(chǔ)上[11-14]，通過RLM-RACE技術(shù)釣取雜交瘤細(xì)胞基因序列，與人源Fc段進(jìn)行拼接，構(gòu)建人鼠嵌合CMV-IgM表達(dá)載體，并通過PCR方法將5種不同的分泌型信號肽 (SigA–SigE) 代替 CMV-IgM 自身信號肽(SigF)，利用CHO作為宿主細(xì)胞進(jìn)行體外表達(dá)。對純化后的 CMV-IgM進(jìn)行 SDS-PAGE、SEC-HPLC和ELISA實驗確定其蛋白表達(dá)水平與免疫活性。這將對人鼠嵌合 CMV-IgM 的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)，且為提高 CMV-IgM 表達(dá)量的研究工作提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株、菌種及載體質(zhì)粒

分泌抗 p52抗原的小鼠雜交瘤細(xì)胞株 CMV 6#由本實驗室研制并保存；Expi CHO購自Gibco；載體質(zhì)粒 pCMV3載體由北京義翹購買并改造后獲得；大腸桿菌Top 10感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技 (北京) 有限公司。

1.1.2 主要試劑

Trizol試劑、FirstChoice? RLM-RACE Kit購自Invitrogen公司；限制性核酸內(nèi)切酶Hind Ⅲ、XbaⅠ、T4 DNA Ligase、轉(zhuǎn)染試劑Expifectamine CHO、補(bǔ)料培養(yǎng)基 (OptiPRO SFM) 和基礎(chǔ)培養(yǎng)基ExpiCHO-S expression medium均購自Thermo公司；質(zhì)粒提取試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自 Omega公司；Protein L親和層析凝膠購自GE公司；p52抗原購自Sigma公司，pp65抗原購自上海允麥生物科技有限公司；PCR引物均由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成。

1.1.3 儀器

PCR儀 (Thermo Fisher, Veriti Thermal Cycler)；瓊脂糖水平電泳儀 (北京六一，DYCP-32B)；臺式離心機(jī) (Sigma，3-30K)；超凈工作臺 (蘇凈安泰，SW-CJ-2D)；細(xì)胞搖床 (科耐，ISF1-XC)；細(xì)胞計數(shù)儀 (上海睿鈺生物，IC 1000)；AKTA purifier (AKTA purifierTMUPC10)；酶標(biāo)儀 (安圖，LUMO型)。

1.2 方法

1.2.1 雜交瘤細(xì)胞RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

收集 5×106個生長狀態(tài)良好的 CMV 6#雜交瘤細(xì)胞。采用Trizol試劑一步法提取總RNA；取RNA (2 μL) 用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%瓊脂糖凝膠電泳分析其完整性，同時用紫外分光光度計測定 RNA的濃度。以其作為模板取5 μg，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，Thermo) 說明書操作，將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在-20 ℃保存。

1.2.2 引物設(shè)計與合成

原始細(xì)胞株經(jīng)鑒定為鼠源 IgG1亞型(Isotyping Kit for Mouse Monoclonal Antibody北京義翹試劑盒)，從 NCBI中獲得鼠 IgG1亞型輕重鏈 Fc段恒定區(qū)序列 (LC028384.1與LC028385.1)，設(shè)計能分別擴(kuò)增重鏈與輕鏈可變區(qū)的下游內(nèi)外引物 (表1)。

1.2.3 CMV 6#單抗含信號肽可變區(qū)基因的克隆

使用RLM-RACE法聯(lián)合巢氏PCR擴(kuò)增目的片段。重鏈與輕鏈可變區(qū)基因反應(yīng)條件：分別使用外引物 (5′ RACE outer primer、Gene specific-H outer primer 與 Gene specific-L outer primer、3′RACE outer primer) (表 1)，94 ℃變性 30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；分別以外引物的PCR產(chǎn)物為模板，使用內(nèi)引物 (5′ RACE inner primer、Gene specific-H inner primer與 Gene specific-L inner primer、3′ RACE inner primer) 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得重/輕鏈可變區(qū)目的基因序列，反應(yīng)條件同外引物一致。凝膠純化回收目的片段，按 DNA A-Tailing kit說明書加“A”尾，分別與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌Top 10，陽性克隆經(jīng)PCR鑒定后，各挑選5個進(jìn)行測序，用VBASE軟件進(jìn)行比對分析。

1.2.4 人鼠嵌合CMV-IgM真核表達(dá)載體構(gòu)建

以1.2.3中陽性克隆的質(zhì)粒為模板，分別使用引物SigF-F、Overlap-H-R和SigF-F、Overlap-L-R(表 2) 擴(kuò)增，獲得帶 CMV 6#自身信號肽的輕重鏈可變區(qū)基因序列；與本實驗室合成的人IgM重鏈恒定區(qū)編碼序列 (Overlap-H-F、H-R擴(kuò)增獲得)和人 Kappa輕鏈恒定區(qū)編碼序列的 PCR產(chǎn)物(Overlap-L-F、L-R擴(kuò)增獲得) 進(jìn)行拼接，分別獲得人鼠嵌合CMV-IgM基因的重鏈和輕鏈完整目的基因序列。用Hind Ⅲ和XbaⅠ對重/輕鏈目的基因及載體 pCMV3 進(jìn)行酶切，并連接獲得帶自身信號肽的質(zhì)粒 CMV-MH-pCMV3和 CMV-L-pCMV3 (圖 1)，送生工生物工程 (上海) 股份有限公司測序，驗證目的基因正確性。

從已報道文獻(xiàn)中選取高效表達(dá)外源蛋白質(zhì)的 5種分泌型信號肽序列 (表 3)，以構(gòu)建好的 CMV-MH-pCMV3為模板，分別利用引物Sig(A-E)-HF、H-R擴(kuò)增目的基因，獲得帶有5種不同信號肽(A-E)的人鼠嵌合CMV-IgM重鏈基因序列。采用同樣方法，以CMV-L-pCMV3為模板，分別利用引物 Sig(A–E)-LF、L-R 獲得 5′端帶有不同信號肽的輕鏈目的基因；分別將帶有不同信號肽的 CMV-IgM 重/輕鏈目的基因片段與載體pCMV3經(jīng)Hind Ⅲ和XbaⅠ酶切，并連接獲得帶Sig(A–E) 信號肽的人鼠嵌合 CMV-IgM 表達(dá)載體，將融合不同信號肽的目的基因進(jìn)行測序，驗證其正確性。

表1 引物設(shè)計Table 1 Design of primer

圖1 人鼠嵌合CMV-IgM真核表達(dá)載體的構(gòu)建Fig. 1 Construction of human-mouse chimeric CMV-IgM expression vector.

表2 構(gòu)建不同信號肽人鼠嵌合CMV-IgM的引物序列Table 2 Primer sequences for constructed human-mouse chimeric CMV-IgM with different signal peptides

表3 信號肽的氨基酸序列及來源Table 3 The amino acid sequence of signal peptide and its origin

1.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與表達(dá)

瞬時轉(zhuǎn)染前 1 d，將 Expi CHO細(xì)胞按照3×106cells/mL密度接種于6個SF125搖瓶中，30 mL/瓶；按照ExpifectamineTMCHO轉(zhuǎn)染試劑盒說明書稀釋質(zhì)粒 DNA和脂質(zhì)體 (轉(zhuǎn)染效率>90%)，以 1 μg∶4 μL 比例瞬時轉(zhuǎn)染 Expi CHO細(xì)胞，24 h后添加補(bǔ)料。培養(yǎng)9 d，細(xì)胞活力降至60%–70%左右，收獲上清，進(jìn)行純化。具有同一種信號肽的輕重鏈重組質(zhì)粒為一種組合，共表達(dá)6種蛋白 (SigA–SigF)。此蛋白表達(dá)實驗重復(fù)3次。

1.2.6 Protein L柱純化與SDS-PAGE檢測

Protein L填料柱子用水和平衡緩沖液(0.02 mol/L PBS，pH 7.4) 平衡后，6種不同信號肽的重組抗體細(xì)胞上清 (SigA–SigF)，分別經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后上樣，上樣后再次平衡，用解離緩沖液 (0.1 mol/L 檸檬酸鈉，pH 2.3) 洗脫蛋白，收集解離峰，使用超微量分光光度計來檢測蛋白濃度，并通過 SDS-PAGE、SEC-HPLC方法檢測蛋白表達(dá)水平。

1.2.7 ELISA檢測人鼠嵌合CMV-IgM的免疫反應(yīng)性

選擇最佳信號肽分泌的目的蛋白進(jìn)行ELISA監(jiān)測。分別包被1 μg/mL檢測抗原 (p52、pp65)，4 ℃孵育過夜；PBST洗滌4次后，用2% BSA于37 ℃封閉1 h；洗滌后加入初始濃度為100 μg/mL的CMV-IgM，以1/3梯度稀釋，37 ℃孵育1 h；洗滌后加入 HRP標(biāo)記的羊抗人二抗，37 ℃孵育1 h；洗滌后加入TMB顯色液顯色10 min，加入終止液 (H2SO4，2 mol/L)，輕輕振蕩用酶標(biāo)儀讀取OD450值。

2 結(jié)果與分析

2.1 CMV 6#可變區(qū)序列分析及不同信號肽表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

采用RLM-RACE技術(shù)聯(lián)合巢式PCR法擴(kuò)增出含有抗體重、輕鏈可變區(qū)基因片段 (VH與VL)，瓊脂糖凝膠電泳分析可見約350 bp的條帶(圖2)，大小與預(yù)期一致，經(jīng)序列分析 (表4)，重鏈可變區(qū)基因長度為336 bp，輕鏈可變區(qū)基因長度為342 bp；經(jīng)鼠源可變區(qū)與人源恒定區(qū) (CH與CL) PCR拼接后，6種不同信號肽 (可變區(qū)序列5′端) 構(gòu)建的人鼠嵌合 CMV-IgM 重鏈 (1–6) 和輕鏈片段 (7–12) 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，可見約1 775 bp和 750 bp大小的片段，均與預(yù)期一致(圖2)。經(jīng)測序證實重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。

2.2 細(xì)胞狀態(tài)與蛋白表達(dá)量監(jiān)測

細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，隔天開始監(jiān)測細(xì)胞密度與存活率 (圖3A–B)，結(jié)果顯示：人鼠嵌合CMV-IgM轉(zhuǎn)染Expi CHO細(xì)胞后，第1天細(xì)胞密度達(dá)到高峰期(9.6×106cells/mL)，隨后細(xì)胞密度與存活率均開始逐步下降，第9天收獲目的蛋白。經(jīng)Protein L柱純化后，根據(jù)蛋白純度換算其表達(dá)量，結(jié)果表明：在本研究 6種信號肽比較中，A信號肽引導(dǎo)CMV-IgM分泌的能力最強(qiáng)，自身信號肽F引導(dǎo)目的蛋白分泌的能力最弱，表達(dá)量最高相差6.72倍(圖 3C)。

圖2 人鼠嵌合CMV-IgM基因凝膠電泳分析Fig. 2 Gel electrophoretic profile of human-mouse chimeric antibody gene CMV-IgM. M: DNA marker; VH: variable region of heavy chain; CH: constant region of heavy chain; VL: variable region of light chain; CL: constant region of light chain; 1–6: the heavy chain fragment of SigA-SigF overlap PCR; 7–12: the light chain fragment of SigA-SigF overlap PCR.

表4 CMV 6#單抗可變區(qū)的序列Table 4 Sequences of CMV 6# monoclonal antibody variable region

圖3 細(xì)胞狀態(tài)與蛋白表達(dá) (A：活細(xì)胞密度；B：細(xì)胞存活率；C：各自信號肽分泌蛋白的表達(dá)量，n=3)Fig. 3 Overview of selected cells and protein expression (SigA–SigF). During the process all cultures were daily analyzed regarding their viable cell concentration (VCD). (A) Viable cell density. (B) Cell viability. (C) The respective expression mean value were calculated for signal peptide A–F (n=3).

2.3 SDS-PAGE與SEC-HPLC檢測蛋白純度

根據(jù) SDS-PAGE分析 6種不同信號肽(SigA–SigF) 分泌的抗體蛋白大小與純度 (圖4A–B)，結(jié)果顯示：目的蛋白CMV-IgM在還原劑(DTT) 處理后膠圖顯示重鏈分子量大小為70 kDa左右，輕鏈分子量大小為25 kDa左右，與預(yù)期相符；經(jīng)Image Lab軟件對電泳圖各泳道分析，不同信號肽 (SigA–SigF) 表達(dá) CMV-IgM 的純度(重輕鏈之和占泳道中總條帶的比值) 分別為93.1%、93.7%、93.1%、97.8%、98.5%、98.6%(圖4A)。非還原狀態(tài)下，抗體蛋白均顯示一條明顯主帶。在主帶下方有少量次帶存在；且不同信號肽分泌表達(dá)的蛋白構(gòu)型無顯著差異 (圖4B)。選擇 CMV-IgM (SigA) 經(jīng)分子篩高效液相色譜法(SEC-HPLC) 檢測顯示：純化后的CMV-IgM蛋白在天然狀態(tài)大多為聚體形式存在，大小在670 kDa與1 340 kDa之間，與預(yù)期相符；且存在少部分單體形式 (大小在200 kDa左右) (圖4C)。

圖4 不同信號肽 (SigA–SigF) 純化后CMV-IgM蛋白SDS-PAGE與SEC-HPLC分析Fig. 4 SDS-PAGE and SEC-HPLC profile of purified CMV-IgM with SigA–SigF. (A) Reduced of samples. (B)Non-reduced of samples. (C) SEC-HPLC (red line: CMV-IgM sample, blue line: 1 340 kDa, 670 kDa, 300 kDa, 150 kDa,45 kDa, 17 kDa, 1 kDa).

2.4 ELISA檢測CMV-IgM的免疫反應(yīng)性

分別用p52和pp65包被酶聯(lián)板，使用最佳信號肽 SigA分泌的抗體蛋白CMV-IgM-SigA通過ELISA進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖5，CMV-IgM可以與p52和 pp65結(jié)合。表明所制備的人鼠嵌合CMV-IgM具有良好的免疫反應(yīng)性。

圖5 ELISA鑒定 Expi CHO表達(dá)的人鼠嵌合CMV-IgMFig. 5 Identification of CMV-IgM antibody expressed by Expi CHO through ELISA.

3 討論

CMV為巨細(xì)胞病毒，CMV-IgM為早期感染的重要指標(biāo)，對新生兒的健康具有非常重要的意義[15]，因此 CMV-IgM 的檢測尤為重要。臨床廣泛采用的ELISA技術(shù)具有靈敏度高、特異性好、試劑穩(wěn)定及成本低廉等優(yōu)點[16]。因此表達(dá)CMV-IgM成了一個可行的策略，重組蛋白表達(dá)量的高低直接關(guān)系到后續(xù)診斷產(chǎn)業(yè)的研發(fā)乃至最終的經(jīng)濟(jì)效益及社會效益。本文研制的人鼠嵌合CMV-IgM，可作為酶聯(lián)免疫檢測試劑盒陽性對照品，利用捕獲法來定性檢測人血清或血漿中的CMV-IgM[17]。

傳統(tǒng)的用于克隆抗體可變區(qū)基因的方法是用一組簡并引物進(jìn)行擴(kuò)增[18]，而抗體可變區(qū)基因高度可變，簡并引物很難與所有的抗體可變區(qū)序列完全匹配，結(jié)果可能導(dǎo)致無法擴(kuò)增或擴(kuò)增出的序列發(fā)生突變。鑒于此，本研究采用 RLM-RACE法釣取目的基因，不僅能擴(kuò)增出目的基因可變區(qū)序列和信號肽序列，還能擴(kuò)增出5′-UTR[19-21]。

IgM 亞型抗體為五聚體，分子量較大，裝配完全時理論大小在 800–900 kDa，且一般為高度糖基化狀態(tài) (每個亞基有 5–6個潛在的糖基化位點)[22–23]。CHO細(xì)胞已被成功用于生產(chǎn)聚合 IgM亞型抗體，但產(chǎn)量較低[24]，給后續(xù)的純化帶來一定難度，因此需要通過其他策略來增加其表達(dá)量。研究表明，改造信號肽是一種有效增加重組蛋白表達(dá)量的方式[10]。信號肽序列輔助翻譯的前體蛋白質(zhì)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，蛋白質(zhì)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中信號肽被切割，蛋白質(zhì)分子進(jìn)行加工修飾，成熟的蛋白質(zhì)中不包含信號肽序列。信號肽對CHO細(xì)胞的生長狀態(tài)、生長活率與外源基因的轉(zhuǎn)錄幾乎沒有影響，卻明顯改變了外源蛋白質(zhì)在培養(yǎng)基中的分泌表達(dá)。據(jù)已有報道，選擇不同的信號肽可以明顯改善 CHO中蛋白質(zhì)的分泌[12]。本研究在制備人鼠嵌合 CMV-IgM 的同時，進(jìn)一步研究信號肽優(yōu)化對其表達(dá)分泌的影響。選擇6種不同來源的信號肽序列 (SigA–SigF) 進(jìn)行亞克隆構(gòu)建并在 CHO細(xì)胞中瞬時表達(dá)，結(jié)果表明，A信號肽融合到CMV-IgM基因的N端而構(gòu)建的表達(dá)載體在CHO細(xì)胞中可以有效引導(dǎo)人鼠嵌合 CMV-IgM 釋放到細(xì)胞外，通過各信號肽蛋白表達(dá)分泌結(jié)果顯示，信號肽對抗體蛋白分泌表達(dá)的影響較大。綜上所述，本研究制備人鼠嵌合 CMV-IgM 并初步探索信號肽對提升蛋白表達(dá)的影響，這對于作為質(zhì)控品通過血清學(xué)研究判斷人體對巨細(xì)胞病毒感染的免疫情況以及是否初次感染有著重要的意義。