王鑫怡，肖曉藝，孫暢，王菲

西南大學(xué) 生物學(xué)研究中心，重慶 400716

無脊椎動物和脊椎動物在長期進(jìn)化過程中形成了非常保守的先天免疫系統(tǒng)[1]。兩者在先天免疫信號途徑中存在諸多同源分子，它們具有相似的結(jié)構(gòu)特征、作用特點(diǎn)和調(diào)控方式。而果蠅作為昆蟲先天免疫研究的模式生物，闡明其先天免疫信號通路中關(guān)鍵蛋白的分子作用機(jī)理，有助于更清楚地了解昆蟲先天免疫信號通路中的調(diào)節(jié)機(jī)制，對研究其他物種的免疫調(diào)控具有重要參考意義。

病原微生物入侵時(shí)，昆蟲體內(nèi)的多層防御機(jī)制被激活，主要包括細(xì)胞免疫和體液免疫[2]。細(xì)胞免疫由血淋巴細(xì)胞介導(dǎo)，依賴吞噬和包裹清除入侵的病原體[3]。體液免疫主要涉及抗菌肽 AMPs(Antimicrobial peptide) 和黑化因子的產(chǎn)生，昆蟲脂肪體產(chǎn)生并分泌AMPs到血淋巴中，裂解殺死細(xì)菌；黑化因子沉積在入侵者的周圍，形成黑色素囊包裹入侵者并將其殺死[4]。果蠅體液先天免疫應(yīng)答主要受兩條NF-κB信號通路——Toll和IMD信號通路調(diào)控[5]。Toll通路主要抵御革蘭氏陽性菌和真菌，產(chǎn)生Drosomycin等抗菌肽[6]；而IMD通路主要感知大多數(shù)革蘭氏陰性菌及少數(shù)具有內(nèi)消旋-二氨基庚二酸型肽聚糖 DAP-type PGN (Diaminopimelic acid-type peptidoglycan) 的革蘭氏陽性菌的感染，產(chǎn)生Attacin、Diptericin等抗菌肽。在IMD信號通路中，跨膜受體 PGRP-LC或膜內(nèi)受體 PGRP-LE識別 DAP-型 PGN，招募膜內(nèi)銜接蛋白 IMD(Immune deficiency)，IMD進(jìn)一步招募配體蛋白FADD (Fas-associated death domain-containing protein) 與Dredd (Death-related ced-3/Nedd2-like protein)，促使Dredd活化，活化的Dredd特異性切割I(lǐng)MD和NF-κB家族轉(zhuǎn)錄因子Relish，切割后的IMD結(jié)合E3泛素化連接酶DIAP2發(fā)生泛素化[7-8]，招募TAK1和IKK[9]，磷酸化切割后的Relish，Relish具有轉(zhuǎn)錄活性的N端進(jìn)入細(xì)胞核，激活A(yù)MPs的表達(dá)[10-11]。

果蠅FADD (dFADD) 是哺乳動物FADD的同源物，其N端具有一個(gè)DED結(jié)構(gòu)域 (Death-effector domain)，C端包含一個(gè)DD結(jié)構(gòu)域 (Death domain)。在IMD信號通路中，dFADD分別通過其DD結(jié)構(gòu)域和 DED結(jié)構(gòu)域與上游同樣包含 DD結(jié)構(gòu)域的IMD和下游同樣包含DED結(jié)構(gòu)域的Dredd相互作用，調(diào)控抗菌級聯(lián)信號的傳遞[12-14]。然而，目前關(guān)于dFADD的研究僅限于功能，其潛在的作用機(jī)制仍不清楚。研究報(bào)道，在IMD信號通路中，果蠅PGRP-LC、PGRP-LE和IMD能夠形成功能性淀粉樣蛋白纖維聚合物，且該淀粉樣蛋白纖維是 IMD信號傳遞所必需的[15]。最近，本研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)家蠶Dredd也能形成功能性蛋白聚合物[16]。

為進(jìn)一步深入研究dFADD在IMD信號通路中的作用機(jī)制，本研究擬通過ThT染料結(jié)合、透射電鏡觀察等鑒定原核表達(dá)純化的 dFADD蛋白在體外能否形成淀粉樣蛋白纖維；通過共聚焦顯微鏡觀察、ThT染色以及 SDD-AGE檢測等方法在細(xì)胞水平上鑒定 dFADD是否在細(xì)胞內(nèi)形成淀粉樣蛋白纖維聚合物；通過構(gòu)建結(jié)構(gòu)域突變體，鑒定纖維形成的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域以及在IMD信號傳遞中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

果蠅S2細(xì)胞系衍生自胚胎，由本實(shí)驗(yàn)室保存,在27 ℃條件下，培養(yǎng)在添加10%胎牛血清 (非熱滅活) 和100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的Schneider’sdrosophilamedium (Gibco) 中。

Tubulin抗體、HRP標(biāo)記山羊抗鼠抗體、BCA蛋白濃度測定試劑盒、NP-40裂解液、DAPI染色液、蛋白酶抑制劑PMSF等購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；HA標(biāo)簽單克隆抗體購自Invitrogen；彩色預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購自 Thermo Scientific；DAP-型PGN購自Sigma；細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑購自 Roche；BL21 (DE3) pLysS感受態(tài)細(xì)胞、Trans-T1噬菌體抗性化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；超純質(zhì)粒試劑盒購自Qiagen；點(diǎn)突變試劑盒購自TaKaRa；pCold-Sumo載體購自 Hai gene；ThT試劑購自 Santa Cruz；Dual-Glo雙熒光素酶活檢測試劑購自Promega。

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建

原核表達(dá)質(zhì)粒 pCold-Sumo-dFADD及真核表達(dá)質(zhì)粒pMT/V5-HisA-HA-dFADD、pMT/V5-HisAHA-dFADD-mCherry的構(gòu)建均根據(jù) NCBI檢索到的各個(gè)基因的CDS序列設(shè)計(jì)引物并擴(kuò)增出正確片段克隆至相應(yīng)載體上，dFADD結(jié)構(gòu)域突變體的構(gòu)建根據(jù)點(diǎn)突變試劑盒使用說明，以上序列均送深圳華大基因股份有限公司測序。本研究所用引物如表1所示，所構(gòu)建載體圖譜如圖1所示。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將細(xì)胞進(jìn)行血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后接種至12孔細(xì)胞板 (1×105個(gè)細(xì)胞/孔)，待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期，0.5 μg/孔的質(zhì)粒與1 μL/孔的脂質(zhì)體混合孵育15 min，轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，5 h后進(jìn)行CuSO4誘導(dǎo) (終濃度為 500 μmol/L)，24 h后收集細(xì)胞用于SDD-AGE檢測或制備細(xì)胞爬片。以上轉(zhuǎn)染均使用分光光度計(jì)對轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒進(jìn)行定量。

1.4 細(xì)胞爬片的制備及ThT染色

將細(xì)胞舊培養(yǎng)基吸凈棄之，添加500 μL 3%多聚甲醛 (PFA) 固定細(xì)胞20 min，PBS輕輕地沖洗一次，添加 500 μL 0.3% Triton-X100，靜置 20 min，添加3 mmol/L ThT搖晃染色20 min (避光操作)，70%乙醇清洗3次/min，PBS清洗3次，每次3 min，添加500 μL DAPI染色液，靜置5 min，PBS清洗3次，每次3 min，向載玻片上滴加3 μL抗熒光淬滅封片液，夾起細(xì)胞爬片置于封片液上，于4 ℃避光保存。dFADD點(diǎn)狀分布和彌散分布細(xì)胞數(shù)量的統(tǒng)計(jì)執(zhí)行3個(gè)孔的重復(fù)。每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù) (200±5) 個(gè)細(xì)胞。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

圖1 dFADD的原核和真核表達(dá)載體圖譜Fig. 1 Prokaryotic and eukaryotic expression vector maps of dFADD. Black line: restriction enzyme cutting site; black box: dFADD ORF; dark grey box: sequence encoding His-Sumo; white box: sequence encoding HA tag;light grey box: sequence encoding mCherry.

1.5 原核表達(dá)純化蛋白及ThT結(jié)合實(shí)驗(yàn)、透射電子顯微鏡觀察

將表達(dá)pCold-Sumo-dFADD質(zhì)粒的菌液于1 L LB氨芐液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)至OD值為0.4–0.6，添加 0.1 mmol/L 的 IPTG，15 ℃、220 r/min誘導(dǎo)蛋白表達(dá)24 h。6 000 r/min、4 ℃離心20 min收菌，用50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)、300 mmol/L NaCl、1 mmol/L β巰基乙醇，5%甘油，1 mmol/L PMSF的緩沖液重懸菌沉淀，超聲破碎7 min 30 s，4 ℃、16 000 r/min離心45 min，收集蛋白上清，掛鎳柱，再用不同濃度梯度的咪唑?qū)⑵湎疵摚琒DS-PAGE鑒定蛋白大小及純度。對目標(biāo)蛋白濃度最高的洗脫液脫鹽處理，Sumo酶酶切30 ℃、1 h，反掛鎳柱，收集流穿液，SDS-PAGE鑒定蛋白純度，BCA測定蛋白濃度。

ThT結(jié)合實(shí)驗(yàn)：用10 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH 7.4) 將純化的 dFADD稀釋至反應(yīng)終濃度為32 μmol/L，ThT反應(yīng)終濃度為 25 μmol/L，再將dFADD進(jìn)行不同程度的梯度稀釋，陽性對照為Aβ蛋白，陰性對照為BSA蛋白，分別將各蛋白樣品于37 ℃、1 000 r/min孵育24 h，孵育體積不少于400 μL。隨后將蛋白樣品轉(zhuǎn)移至96孔黑色酶標(biāo)板，添加新鮮配制的ThT溶液，搖晃孵育15 min，上機(jī)檢測：固定激發(fā)光為440 nm，檢測470–600 nm不同發(fā)射光的熒光強(qiáng)度。

透射電子顯微鏡觀察：吸取終濃度為37 μmol/L的蛋白樣品滴加于銅網(wǎng)格上，吸附1 min，風(fēng)干，用2%乙酸鈾酰水溶液負(fù)染45 s，去除多余染液，風(fēng)干，透射電鏡觀察，電壓200 kV。

1.6 SDD-AGE

凝膠制備：1×TBE配制含0.1% SDS的1.5%瓊脂糖凝膠。樣品制備：將細(xì)胞裂解物 (細(xì)胞裂解液：NP-40裂解液+1 mmol/L DTT+2 mmol/L PMSF)與蛋白上樣緩沖液 (配制4×母液：2×TBE，20%甘油，8% SDS，0.2%溴酚藍(lán)，室溫保存，使用終濃度為1×) 混合，37 ℃孵育5 min，蛋白上樣總量為80 μg。電泳：水平凝膠電泳 (電泳緩沖液：1×TBE+0.1% SDS)，恒壓3 V/cm (凝膠寬度)，于4 ℃冰箱中進(jìn)行。毛細(xì)管轉(zhuǎn)膜：由下往上依次放置：5 cm干濾紙、一層轉(zhuǎn)膜緩沖液 (1×TBS) 浸濕濾紙、PVDF膜、凝膠、一層浸濕濾紙、一層浸濕濾紙橋。室溫靜置 9 h。轉(zhuǎn)膜完成后，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)的 Western blotting檢測。

1.7 雙熒光素酶檢測

將舊培養(yǎng)基吸凈棄之，添加300 μL PBS重懸細(xì)胞于 1.5 mL離心管，10 000 r/min、4 ℃離心5 min。吸取120 μL Dual-Glo雙熒光素酶活檢測試劑重懸細(xì)胞，室溫?fù)u晃裂解 15 min，吸取 50 μL至96孔黑色酶標(biāo)板，用GloMax-Multi微孔酶標(biāo)儀讀數(shù)。取出酶標(biāo)板，吸取50 μL終止反應(yīng)檢測試劑加入對應(yīng)孔中，搖晃混勻 10 min，使用酶標(biāo)儀讀數(shù)。本實(shí)驗(yàn)采用海腎熒光素酶質(zhì)粒作為內(nèi)參。每個(gè)樣品取 3個(gè)孔的重復(fù)，數(shù)據(jù)用±s表示，并通過ANOVA單因素方差分析后采用鄧肯氏 (Duncan)新復(fù)極差測驗(yàn)法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 dFADD在體外形成淀粉樣蛋白纖維聚合物

采用帶有His-Sumo標(biāo)簽的pCold-Sumo載體原核表達(dá)純化His-Sumo-dFADD，該蛋白在200 mmol/L咪唑濃度下被大量洗脫 (圖 2A)，隨后使用 Sumo酶切除His-Sumo標(biāo)簽，得到大小為27 kDa的蛋白dFADD (圖 2B)。分別使用灰度計(jì)算軟件Image J及BCA蛋白濃度測定法對該蛋白的純度和濃度進(jìn)行分析，結(jié)果表明，dFADD純度和濃度分別約為96.2%和 37 μmol/L，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。硫黃素 T(ThT) 是一種淀粉樣蛋白纖維聚集體的特異性熒光染料。ThT與淀粉樣蛋白纖維結(jié)合后，光譜性質(zhì)發(fā)生變化，激發(fā)波長從335 nm增加至445 nm，發(fā)射波長由400 nm增加至485 nm。ThT結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明，dFADD能夠與ThT染料特異性結(jié)合，改變ThT的光譜性能，使其在440 nm的激發(fā)光下，在發(fā)射波490 nm處產(chǎn)生與陽性對照——典型的β淀粉樣蛋白Aβ一樣的峰值 (圖2C)，且呈現(xiàn)出劑量依賴效應(yīng)。純化的dFADD蛋白在透射電子顯微鏡下呈現(xiàn)明顯的聚集現(xiàn)象 (圖2D)，dFADD發(fā)生明顯聚集，但大多數(shù)為無定形聚集 (如白色箭頭所示)，只有少數(shù)部分能夠聚合形成較大的聚集體 (如黃色箭頭所示)，且該聚集體整體呈現(xiàn)為纖維狀。綜上所述，dFADD在體外可聚集形成淀粉樣蛋白纖維聚合物。

圖2 dFADD的原核表達(dá)純化、ThT結(jié)合及透射電子顯微鏡觀察Fig. 2 Prokaryotic expression and purification, ThT binding and transmission electron microscopy of dFADD. (A) Imidazole concentration gradient elution of dFADD. 1: supernatant; 2: sedimentation; 3: flow through; 4: 0 mmol/L; 5: 10 mmol/L; 6:20 mmol/L; 7: 50 mmol/L; 8: 100 mmol/L; 9: 200 mmol/L; 10: 300 mmol/L; 11: 500 mmol/L; 12: 800 mmol/L; 13: 1 mol/L;M: protein pre-stained marker (kDa); black arrowhead: His-Sumo-dFADD. (B) The imidazole concentration gradient elution of dFADD after digested by Sumo enzyme. 1: uncut; 2: after digestion; 3: flow through; 4: 0 mmol/L; 5: 10 mmol/L; 6:20 mmol/L; 7: 50 mmol/L; 8: 100 mmol/L; 9: 200 mmol/L; 10: 500 mmol/L; M: protein pre-stained marker (kDa); black arrowhead: His-Sumo-dFADD; brown arrowhead: dFADD; blue arrowhead: Sumo enzyme; gray arrowhead: His-Sumo. (C)ThT binding assay of dFADD. (D) Transmission electron microscopy of dFADD. White arrowhead: amorphous aggregation of dFADD; Yellow arrowhead: amyloid fiber aggregates of dFADD.

2.2 dFADD在細(xì)胞內(nèi)形成淀粉樣蛋白纖維聚合物

為探究dFADD在體內(nèi)是否形成淀粉樣蛋白纖維聚合物，模擬在體外培養(yǎng)果蠅S2細(xì)胞中過表達(dá)dFADD-mCherry融合蛋白，通過共聚焦顯微鏡觀察 dFADD的細(xì)胞定位及分布情況，發(fā)現(xiàn) dFADD在果蠅 S2細(xì)胞中呈現(xiàn)兩種分布：一種呈點(diǎn)狀(圖3A)，此種形式數(shù)量較少，但其熒光強(qiáng)度較亮；另一種則彌散分布于整個(gè)細(xì)胞質(zhì)中，熒光強(qiáng)度較弱一些 (圖3B)。在果蠅IMD信號通路中一些能夠形成淀粉樣蛋白纖維聚合物的蛋白，如 PGRP-LC等也呈現(xiàn)這樣的點(diǎn)狀聚集形式[15]，因此推測這種點(diǎn)狀分布的dFADD可能也是蛋白聚合體。為排除蛋白聚集是由于過量表達(dá)所造成的，同時(shí)轉(zhuǎn)染了等量的mCherry蛋白表達(dá)載體 (圖3C)，該蛋白均勻分布于細(xì)胞中，證實(shí)過量表達(dá)不會造成蛋白的聚集。

圖3 dFADD的熒光觀察、ThT染色及SDD-AGE檢測Fig. 3 Fluorescence observation, ThT staining and SDD-AGE detection of dFADD. (A) Puncta-like distribution of dFADD-mCherry. (B) Diffuse distribution of dFADD-mCherry. (C) Diffuse distribution of mCherry. (D) Puncta-like distribution of dFADD-mCherry specifically binds to ThT. (E) Diffuse distribution of dFADD-mCherry does not specifically bind to ThT. (F) SDD-AGE detection of HA-dFADD.

對過表達(dá)dFADD-mCherry蛋白的S2細(xì)胞進(jìn)行 ThT染色，經(jīng)熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)點(diǎn)狀分布的dFADD與ThT綠色熒光重疊，表明其能夠與ThT特異性結(jié)合，這些點(diǎn)狀物即為淀粉樣蛋白纖維聚合物 (圖3D)。相反，彌散分布的dFADD則未呈現(xiàn)出ThT綠色熒光 (圖3E)，表明其未發(fā)生聚合。這些結(jié)果表明 dFADD在細(xì)胞內(nèi)部分形成淀粉樣蛋白纖維聚合物，這與電鏡觀察的結(jié)果一致。SDD-AGE是一種半變性瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)，該技術(shù)SDS用量少，基本不破壞聚集體，并借助疏松網(wǎng)狀的瓊脂糖凝膠進(jìn)行大分子蛋白的遷移。本研究通過SDD-AGE檢測過表達(dá)HA-dFADD的S2細(xì)胞裂解物，發(fā)現(xiàn)HA-dFADD在細(xì)胞內(nèi)以單體與聚合物共存 (圖3F)。

2.3 DED結(jié)構(gòu)域是dFADD纖維形成的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域

為探究dFADD淀粉樣蛋白纖維的形成與哪一個(gè)結(jié)構(gòu)域有關(guān)，構(gòu)建了刪除dFADD結(jié)構(gòu)域的真核表達(dá)載體 (圖4A)，SDS-PAGE檢測各突變體蛋白成功表達(dá) (圖 4B)。隨后對 dFADD-WT及其突變體進(jìn)行 SDD-AGE檢測，結(jié)果顯示，dFADD-WT存在聚合物和單體兩種形式，且單體量較高；dFADD-ΔDED 僅以單體形式存在；dFADD-ΔDD則表現(xiàn)出單體明顯減少、聚合物明顯增多的特征(圖4C)。熒光觀察結(jié)果顯示，dFADD-ΔDD在細(xì)胞內(nèi)具有聚集和彌散兩種分布，其聚集形式能夠被ThT染色，呈現(xiàn)綠色熒光；而dFADD-ΔDED僅有彌散分布一種形式，不能與ThT結(jié)合 (圖4D、E)。同時(shí)對dFADD及其突變體的聚集形式和彌散形式的比例進(jìn)行了統(tǒng)計(jì) (圖4F)，dFADD-WT的聚集比例為 19.23%，dFADD-ΔDED 的聚集比例為 0，dFADD-ΔDD的聚集比例為 31.77%。此外，PGN刺激后，dFADD-WT和dFADD-ΔDD的聚集比例均有所上升，分別為24.10%和38.22%。以上結(jié)果均表明，DED結(jié)構(gòu)域是dFADD纖維形成的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，且PGN刺激能夠誘導(dǎo)更多dFADD聚集。

2.4 dFADD纖維形成是IMD信號傳遞的關(guān)鍵

為進(jìn)一步探究dFADD形成的淀粉樣蛋白纖維在IMD信號通路中的作用，在細(xì)胞中表達(dá)dFADD或其突變體，利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)對抗菌肽Attacin和 Diptericin的誘導(dǎo)水平進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示，在 PGN刺激下，dFADD-ΔDED對抗菌肽的表達(dá)無促進(jìn)作用，或遠(yuǎn)低于 dFADD-WT和dFADD-ΔDD；而蛋白聚合比例較高的dFADD-ΔDD，促進(jìn)抗菌肽表達(dá)的作用則高于dFADD-WT (圖 5A、B)。以上結(jié)果表明，dFADD淀粉樣蛋白纖維的形成是IMD信號通路傳遞的關(guān)鍵，是誘導(dǎo)抗菌肽產(chǎn)生所必需的。

3 討論

淀粉樣蛋白聚集體最早被發(fā)現(xiàn)與人類淀粉樣蛋白疾病有關(guān)。某些蛋白或多肽錯(cuò)誤折疊并形成淀粉樣蛋白纖維，在器官和組織的胞外空間中沉積，從而導(dǎo)致疾病發(fā)生，例如Aβ蛋白導(dǎo)致的阿爾茨海默氏癥，阮病毒蛋白導(dǎo)致的海綿狀腦病，α核蛋白導(dǎo)致的帕金森病等[17]。然而，近年來從細(xì)菌到昆蟲再到人類，逐漸發(fā)現(xiàn)一些功能性淀粉樣蛋白纖維，它們并不導(dǎo)致疾病發(fā)生，而是在體內(nèi)發(fā)揮正常的生理功能，例如PMEL形成淀粉樣纖維作為支架沉積和儲存哺乳動物黑色素；熒光假單胞菌的FapC組成的原纖維有助于生物膜的形成和穩(wěn)定；生殖特異性胱抑素蛋白Cst8在體外形成淀粉樣蛋白原纖維，在精子成熟或維持管腔環(huán)境中發(fā)揮作用[18-20]。對哺乳動物信號傳導(dǎo)的研究發(fā)現(xiàn)，RIPK1和RIPK3的RIP同型相互作用基序RHIMs介導(dǎo)了其異二聚體絲狀結(jié)構(gòu)的組裝，二者形成淀粉樣蛋白纖維復(fù)合物，在誘導(dǎo)細(xì)胞程序性壞死的信號通路中是不可或缺的[21-23]。與此相似的是，在昆蟲的IMD免疫信號通路中，PGRP-LC、PGRP-LE、IMD三種蛋白形成功能性淀粉樣蛋白纖維聚合物，PGRP-LC或PGRP-LE首先聚合形成淀粉樣蛋白原纖維，成為下游IMD纖維聚合的核心，促進(jìn)IMD的聚合，纖維形成是IMD通路的信號傳遞所必需的[15]。這暗示著對于哺乳動物和昆蟲，信號分子的組織形式和信號傳遞方式具有進(jìn)化上的保守性。dFADD纖維參與IMD級聯(lián)調(diào)控的分子作用尚需要后續(xù)深入研究。

圖4 dFADD-WT及其突變體真核表達(dá)載體的構(gòu)建、SDD-AGE檢測及熒光觀察Fig. 4 Eukaryotic expression vector construction, SDD-AGE detection and fluorescence observation of domain-deleted mutants of dFADD. (A) Schematic diagram of dFADD-WT and its domain-deleted mutants. (B)SDS-PAGE detection of dFADD-WT and its mutants. M: protein pre-stained marker (kDa). (C) SDD-AGE detection of dFADD-WT and its mutants. (D) Fluorescence observation of dFADD’s mutants. (E) Fluorescence observation of dFADD’s mutants after ThT staining. (F) The ratio of puncta-like vs. diffuse distribution of dFADD and its mutants in the absence or presence of PGN.

圖5 dFADD-WT及其突變體對抗菌肽表達(dá)的影響Fig. 5 Effect of dFADD-WT and its mutants on the expression of antimicrobial peptides. (A) Effect of dFADD-WT and its mutants on the expression of the antibacterial peptide Attacin. (B) Effect of dFADD-WT and its mutants on the expression of the antibacterial peptide Diptericin. PGN: DAP-type PGN (10 μg/mL). a–f: differences are assigned by letters, overlapping letters mean no significance.

本研究發(fā)現(xiàn)dFADD也能夠自組裝聚合成類似的功能性淀粉樣蛋白纖維，其能夠與淀粉樣蛋白纖維特異性染料結(jié)合，在透射電子顯微鏡下呈現(xiàn)明顯的高分子聚合特征，形似纖維。然而，該分子在體外或在模擬體外培養(yǎng)果蠅S2細(xì)胞中的聚合能力是較弱的，少數(shù)形成纖維，大部分仍是以無定形的較小聚合物形式存在，或者不發(fā)生聚合以單體形式存在。在PGN刺激下，dFADD形成聚集體的能力有所增強(qiáng)，說明其聚集響應(yīng)免疫誘導(dǎo)。而dFADD-ΔDED突變體不能形成淀粉樣蛋白纖維聚合物并且無法誘導(dǎo)抗菌肽Attacin和Diptericin的表達(dá)，進(jìn)一步說明了淀粉樣蛋白纖維在免疫信號通路中的作用。這些結(jié)果提示dFADD纖維分子可能作為原纖維核心在IMD信號通路中協(xié)同參與了上游IMD的淀粉樣蛋白纖維的形成，改變IMD纖維特征，促進(jìn)與下游分子Dredd等分子的相互作用，調(diào)控抗菌級聯(lián)信號的傳遞。

有意思的是，dFADD-ΔDD 突變體對抗菌肽Attacin和Diptericin表達(dá)的促進(jìn)能力明顯增強(qiáng)，可能暗示dFADD的DD結(jié)構(gòu)域?qū)FADD淀粉樣蛋白纖維的形成有一定程度的干擾。類似現(xiàn)象也存在于哺乳動物 FADD介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號通路中，F(xiàn)ADD的DED結(jié)構(gòu)域能夠形成死亡效應(yīng)纖絲，該纖絲的形成是細(xì)胞凋亡信號傳遞所必需的。當(dāng)只表達(dá) DED結(jié)構(gòu)域時(shí)，細(xì)胞凋亡率要高于同時(shí)包含DED結(jié)構(gòu)域和 DD結(jié)構(gòu)域的全長型FADD[24-27]，說明在無DD結(jié)構(gòu)域存在的情況下，DED結(jié)構(gòu)域的功能可能有所增強(qiáng)。統(tǒng)計(jì)dFADD-mCherry及其突變體在細(xì)胞中呈現(xiàn)聚合形式的比例，發(fā)現(xiàn)dFADD-ΔDD 呈現(xiàn)聚合的比例高于 dFADD-mCherry-WT，這也與二者促進(jìn)抗菌肽產(chǎn)生的能力相對應(yīng)，當(dāng)dFADD聚合物增多時(shí)，其促進(jìn)抗菌肽產(chǎn)生的能力進(jìn)一步增強(qiáng)。

dFADD 通過其 DED 結(jié)構(gòu)域與 Dredd(Caspase8同源物) 相互結(jié)合，促進(jìn)下游抗菌肽的產(chǎn)生或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Dredd的 N端也包含兩個(gè)DED結(jié)構(gòu)域[28]。筆者研究團(tuán)隊(duì)在研究家蠶 Dredd時(shí)，發(fā)現(xiàn)BmDredd能夠聚合形成淀粉樣蛋白纖維，且BmDredd與BmFADD的細(xì)胞共定位表明，二者能夠共同聚合形成淀粉樣蛋白纖維聚合物[16]，這提示了果蠅 Dredd也可能形成淀粉樣蛋白纖維聚合物。由此 IMD信號通路中，已鑒定或預(yù)測到PGRP-LC、PGRP-LE、IMD、dFADD與Dredd均能夠形成淀粉樣蛋白纖維聚合物，暗示它們能夠組裝形成類似于在哺乳動物細(xì)胞中鑒定到的超分子復(fù)合物，對迅速高效的免疫信號傳遞和抗菌肽的誘導(dǎo)至關(guān)重要，值得深入研究。