戰(zhàn)鑫 臺(tái)蓮梅* 劉銅 張有利 鄭雯 靳亞忠

（1黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，黑龍江 大慶163319；2 海南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，?？?70228；第一作者：1323834999@qq.com；*通訊作者：tailianmei@sina.com；liutongamy@sina.com）

黑龍江省寒地水稻種植面積大約為332.5 萬(wàn)hm2，占全國(guó)水稻種植面積的11.0%，是我國(guó)水稻種植面積最大的省[1]。水稻立枯病是水稻育苗階段最常見(jiàn)的一種病害，嚴(yán)重發(fā)生時(shí)會(huì)引起秧苗成片爛秧和枯死。有研究報(bào)道，水稻立枯病由多種病原菌復(fù)合侵染所引起，不同地區(qū)的病原菌優(yōu)勢(shì)種有所不同，黑龍江地區(qū)主要優(yōu)勢(shì)病原菌為禾谷鐮孢菌Fusarium graminearum、茄腐鐮孢菌Fusarium solani、尖孢鐮孢菌Fusarium oxysporium和立枯絲核菌Rhizoctonia solani[2]。在生產(chǎn)上，目前黑龍江主要采用惡霉靈防治水稻立枯病[3]。有報(bào)道申嗪霉素、咪鮮胺、惡霉靈等藥劑混配室內(nèi)對(duì)病菌有一定的抑制作用，但生產(chǎn)中未應(yīng)用[4-5]。由于長(zhǎng)期應(yīng)用單一的殺菌劑防治立枯病，易使病原菌產(chǎn)生抗藥性，降低防效，并造成環(huán)境污染。因此，尋找和研發(fā)生防制劑防治水稻立枯病，對(duì)水稻綠色優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)具有重要意義。

木霉菌是廣泛存在于土壤中，具有拮抗植物病原物的重要生防微生物，在植物病害生物防治過(guò)程中具有重要的、不可忽視的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，木霉菌對(duì)植物病原菌具有廣譜性的拮抗作用，目前發(fā)現(xiàn)至少對(duì)18個(gè)屬29 種病原真菌有拮抗作用[6]。木霉菌可以防治多種由鐮孢菌、絲核菌引起的病害，如甜瓜根腐病、玉米紋枯病。但是，木霉菌對(duì)水稻立枯病拮抗作用的研究報(bào)道很少。本文擬通過(guò)對(duì)峙培養(yǎng)、代謝物質(zhì)對(duì)引起寒地水稻立枯病的4 種病原菌抑制作用及幾丁質(zhì)酶的活性的檢測(cè)，研究2 種木霉菌對(duì)引起水稻立枯病的4 種病原菌的拮抗效果，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)復(fù)合木霉菌制劑防治水稻立枯病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株

供試原菌：禾谷鐮孢菌Fusarium graminearum、尖孢鐮孢菌Fusarium oxysporium、茄腐鐮孢菌Fusarium solani以及立枯絲核菌Rhizoctonia solani。

供試木霉菌菌株：哈茨木霉（Trichoderma.harziamun）和短密木霉（Trichoderma.breve）。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

PDA 培養(yǎng)基、PD 培養(yǎng)液。

木霉菌幾丁質(zhì)酶產(chǎn)酶培養(yǎng)基：稱取粉末狀幾丁質(zhì)0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，MgSO4·7H2O 0.06 g，KH2PO40.2 g，NH4NO30.3 g，蒸餾水定容至100 mL。

DNS 溶液：37.4 g 酒石酸鉀鈉溶于少量蒸餾水中，加熱至75℃，依次加入3,5 二硝基水楊酸1.26 g、NaOH 4.2 g、無(wú)水硫酸鈉1.0 g，攪拌至溶解。冷卻后用蒸餾水定容至200 mL。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 對(duì)峙培養(yǎng)

將哈茨木霉和短密木霉和4 種病原菌從保存試管斜面中轉(zhuǎn)接于PDA 培養(yǎng)基上，于25℃恒溫培養(yǎng)5 d。用打孔器（φ=5 mm）將木霉菌和病原菌打成菌餅，分別對(duì)稱接種到平板PDA 培養(yǎng)基兩側(cè)，中間相距6 cm。培養(yǎng)7 d 后測(cè)量病原菌菌落指向木霉的半徑，空白對(duì)照測(cè)量病原菌指向圓心的半徑，計(jì)算抑制率，并觀察拮抗效果，每個(gè)處理5 次重復(fù)。

2.4 兩組患者治療前后PV及IPSS評(píng)分比較 常規(guī)治療組患者治療前后IPSS評(píng)分、PV差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。非那雄胺組患者治療后IPSS評(píng)分較治療前明顯改善，PV明顯縮小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。非那雄胺組患者治療后IPSS評(píng)分及PV較常規(guī)治療組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表1 2 種木霉菌對(duì)4 種病原菌生長(zhǎng)抑制及拮抗作用

圖1 2 種木霉菌對(duì)4 種病原菌生長(zhǎng)的拮抗

抑制率=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑×100%

拮抗效果分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ，木霉菌絲占據(jù)平皿100%；Ⅱ，木霉菌絲占據(jù)平皿＞2/3；Ⅲ，木霉菌絲占據(jù)平皿＞1/3但＜2/3；Ⅳ，木霉菌絲占據(jù)平皿＜1/3；Ⅴ，病原菌（指示菌）占據(jù)平皿100%。

1.2.2 發(fā)酵液對(duì)病原菌的抑制作用

將活化的木霉轉(zhuǎn)接于PD 培養(yǎng)基中，置于搖床中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為150 r/min，在25℃下培養(yǎng)7 d 后，收集發(fā)酵液，然后用0.22 μm 無(wú)菌濾膜過(guò)濾，將10 mL 過(guò)濾液與加熱的40 mL PDA 培養(yǎng)基混合均勻后倒平板，分別轉(zhuǎn)接4 種不同的病原菌，對(duì)照為10 mL PD 培養(yǎng)基與40 mL PDA 培養(yǎng)基均勻混合倒平板。在28℃下培養(yǎng)3 d 后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算發(fā)酵液對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用，試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.3 揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)病原菌的抑制作用

揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)病原菌的抑制作用采用對(duì)扣培養(yǎng)法[8]，木霉菌菌餅（φ=5 mm）接種于PDA 平板中央，28℃恒溫培養(yǎng)2 d，在平板上方鋪蓋1 張直徑為9 cm 的單層無(wú)菌玻璃紙，然后對(duì)扣1 個(gè)大小相等且接有直徑5 mm 的病原菌菌餅的平板，封口膜密封后，28℃恒溫培養(yǎng)。以只接種病原菌的平板對(duì)扣處理作為對(duì)照，每處理重復(fù)3 次，3 d 后計(jì)算抑制率。

1.2.4 非揮發(fā)物質(zhì)對(duì)病原菌的抑制作用

1.2.5 幾丁質(zhì)酶活性檢測(cè)

首先制備膠態(tài)幾丁質(zhì)，其制備方法參照Berger[9]。幾丁質(zhì)酶活性測(cè)定具體操作方法：將發(fā)酵2 d、3 d、4 d、5 d、6 d 的發(fā)酵液經(jīng)三層紗布過(guò)濾，然后取5 mL 濾液加入2.0 mL 膠態(tài)幾丁質(zhì)，于37℃保溫3 h，然后取2.0 mL 濾液加入1.5 mL DNS、1.0 mL 緩沖液，沸水浴10 min，冷水冷卻至室溫，540 nm 比色測(cè)定OD 值。以100℃滅活10 min 的酶液為空白對(duì)照，3 次重復(fù)。以1 mL 粗酶液每小時(shí)分解膠態(tài)幾丁質(zhì)產(chǎn)生l μmol 還原糖（葡萄糖）的酶量定義為1 個(gè)酶單位（U）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用WPS 2019 和SPSS 20.0 對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)4 種病原菌的抑制和拮抗作用

通過(guò)對(duì)峙培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，哈茨木霉和短密木霉對(duì)4 種病原菌的生長(zhǎng)抑制作用有明顯差異（表1）。哈茨木霉對(duì)尖孢鐮孢菌的抑制率最大，為79.04%；短密木霉對(duì)禾谷鐮孢菌的抑制率最大，為88.6%。然而2 種木霉對(duì)立枯絲核菌的抑制率均最小，分別45.63%和48.59%。通過(guò)拮抗觀察，2 種木霉對(duì)尖孢鐮孢菌和茄腐鐮孢菌拮抗效果相似，但是短密木霉對(duì)禾谷鐮孢菌和立枯絲核菌比哈茨木霉拮抗效果更強(qiáng)。

表2 2 種木霉菌發(fā)酵液對(duì)4 種病原菌的抑制作用

表3 2 種木霉揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)病原菌的抑制作用

表4 木霉非揮發(fā)物質(zhì)對(duì)病原菌的抑制作用

表5 2 種木霉菌幾丁質(zhì)酶活性測(cè)定 （U/mL）

2.2 發(fā)酵液對(duì)病原菌的抑制作用

由表2 可以看出，2 種木霉菌代謝液對(duì)4 種病原菌均有抑制作用，但是對(duì)不同的病原菌的抑制作用有顯著差異。哈茨木霉發(fā)酵液對(duì)尖孢鐮孢菌抑制率較高，為58.24%，與其他病原菌的處理差異顯著；對(duì)茄腐鐮孢菌和禾谷鐮孢菌的抑制率較低，分別為36.74%和43.30%。短密木霉發(fā)酵代謝液對(duì)茄腐鐮孢菌和禾谷鐮孢菌的抑制率較高，對(duì)尖孢鐮孢菌和立枯絲核菌的抑制率較低。

2.3 揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)病原菌的抑制作用

采用對(duì)扣培養(yǎng)法測(cè)定了2 種木霉揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)病原菌的抑制作用。從表3 可見(jiàn)，哈茨木霉和短密木霉均能產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)抑制4 種病原菌的生長(zhǎng)，但抑制作用不強(qiáng)，短密木霉對(duì)茄腐抑制率最高，但是僅為35.29%，對(duì)禾谷鐮孢菌抑制效果最差，僅為6.17%。兩種木霉菌對(duì)4 種病原菌的抑制效果有顯著差異。

2.4 非揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)病原菌的抑制作用

利用圓盤濾膜法測(cè)定了哈茨木霉與短密木霉的難揮發(fā)物質(zhì)對(duì)4 種病原菌的抑制作用。從表4 可見(jiàn)，2 種木霉菌產(chǎn)生的非揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)4 種病原菌的抑制作用較強(qiáng)，抑制率均在55.00%以上。其中，對(duì)禾谷鐮孢菌的抑制效果最好，抑制率分別為66.78%和70.12%，與其他病原菌處理差異顯著。與揮發(fā)性物質(zhì)相比，難揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)病原菌有更強(qiáng)的抑制效果。

2.5 幾丁質(zhì)酶活性檢測(cè)

2 種木霉菌株分別在培養(yǎng)第3、4、5、6、7 d 后進(jìn)行幾丁質(zhì)酶活性檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2 種木霉菌均能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶，隨著培養(yǎng)時(shí)間增加酶的活性逐漸升高，第4 d達(dá)到最大值，隨后酶的活性逐漸降低。哈茨木霉的幾丁質(zhì)酶的活性最高為1.46 U/mL、短密木霉的幾丁質(zhì)酶活性最高為1.00 U/mL。哈茨木霉產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶活性顯著高于短密木霉產(chǎn)生的酶活性（表5）。

3 結(jié)論與討論

水稻立枯病的防治主要采用化學(xué)防治方法，其防治效果不明顯，并對(duì)環(huán)境有較大的污染。運(yùn)用木霉菌進(jìn)行綠色防治，發(fā)展綠色農(nóng)業(yè)十分有意義。選擇拮抗效果好的木霉菌是研制木霉菌制劑的前提。李和平等[10]只通過(guò)對(duì)峙試驗(yàn)的方法來(lái)篩選木霉菌，篩選方式過(guò)于單一。本研究系統(tǒng)的通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)作用、抗生作用、溶菌作用等方法研究，能更好地了解哈茨木霉與短密木霉對(duì)黑龍江地區(qū)水稻立枯病菌的拮抗作用。

研究結(jié)果顯示，2 種木霉菌具有較強(qiáng)的營(yíng)養(yǎng)和空間競(jìng)爭(zhēng)能力；2 種木霉的非揮發(fā)性物質(zhì)比揮發(fā)性物質(zhì)具有更強(qiáng)的抑制效果，表明木霉的抑菌物質(zhì)主要來(lái)源于非揮發(fā)性物質(zhì)，這與前人報(bào)道相一致[8]。木霉菌可以產(chǎn)生大量化學(xué)性質(zhì)各不相同的抗菌物質(zhì), 包括戊酮、辛酮、類菇、多膚和氨基酸衍生物等幾大類，其中僅抗真菌的代謝產(chǎn)物便超過(guò)70 種，并且多數(shù)木霉產(chǎn)生的抗生物質(zhì)不止一種[11-14]。如哈茨木霉可產(chǎn)生12 種，康氏木霉菌可產(chǎn)生9 種，綠色木霉可產(chǎn)生10 種，鉤狀木霉可產(chǎn)生7 種，長(zhǎng)枝木霉可產(chǎn)生3 種，多孢木霉可產(chǎn)生2 種?？梢?jiàn)，不同種木霉菌的抗生能力不同。因此，在使用木霉菌進(jìn)行生物防治時(shí)應(yīng)多種木霉菌復(fù)配以提高防治效果。本研究結(jié)果表明，哈茨木霉的幾丁質(zhì)酶活性高于短密木霉，但是短密木霉卻有更好的營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)能力和抗生作用。說(shuō)明2 種木霉菌對(duì)供試的4 種病原菌抑制效果不完全一致，與前人報(bào)道相符合[15]。通過(guò)室內(nèi)研究后，下一步將哈茨木霉與短密木霉進(jìn)行復(fù)配應(yīng)用于田間，驗(yàn)證2 種木霉菌對(duì)水稻立枯病的防效。本研究結(jié)果可為下一步研發(fā)木霉菌制劑防治寒地水稻立枯病提供依據(jù)，但對(duì)木霉菌的協(xié)同抗性有待深入研究。