林結(jié)桃 李 健 成文翔 SUN Antonia 陳建?？蔓惽?甘東浩 張 鵬

1(中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院 深圳 518055)

2(中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049)

3(深圳市醫(yī)用生物活性材料工程研究中心 深圳 518000)

1 引 言

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一種主要侵蝕關(guān)節(jié)的慢性、全身性自身免疫疾病[1]。不可控的 RA 常導(dǎo)致關(guān)節(jié)損傷、殘疾、心血管疾病和其他并發(fā)癥的發(fā)生，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。據(jù)統(tǒng)計(jì)，RA 在全球范圍內(nèi)發(fā)病率為 1%～2%，多見于婦女及老年人[2]。由于我國人口基數(shù)巨大，RA 患者人數(shù)已達(dá) 480 萬[3]。目前 RA 發(fā)生的病因尚未明確，多認(rèn)為與性別、家族性遺傳和吸煙等有關(guān)[4]。臨床上常用的治療藥物，如傳統(tǒng)抗風(fēng)濕藥物甲氨喋呤、來氟米特以及生物制劑(如腫瘤壞死因子抑制劑——TNFi 等)，雖然都可在一定程度上減緩病癥，但不良反應(yīng)往往限制了其應(yīng)用，故研發(fā)安全、有效且廉價(jià)的 RA 治療藥物非常有必要[5]。由于新藥研發(fā)前期成本昂貴且失敗率極高，藥物安全性和有效性難以得到高效評(píng)估，導(dǎo)致有效治療藥物發(fā)展緩慢[6]。因此，若想更好地進(jìn)行藥物開發(fā)，需要對(duì) RA 的發(fā)病機(jī)理進(jìn)行深入探索，以期能找到新的藥物作用靶點(diǎn)。

RA 的主要病理特征包括滑膜細(xì)胞異常增生、炎性細(xì)胞遷移聚集、血管翳新生等，最終引起軟骨破壞和骨侵蝕[7]。血管生成是 RA 的早期表現(xiàn)，RA 患者的關(guān)節(jié)滑膜通常含有豐富的血管，體內(nèi)外眾多研究均表明血管生成在 RA 的病程中起著極其重要的作用[8]。其中，血管生成不僅為增生的滑膜細(xì)胞提供更多的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，還為炎癥因子的擴(kuò)散提供了更多的渠道，同時(shí)也為白細(xì)胞的浸潤提供了病理?xiàng)l件，最終促進(jìn)了滑膜炎癥的發(fā)展和骨、軟骨的破壞[9]。此外，滑膜纖維組織增生后會(huì)和周圍的新生血管共同形成血管翳，對(duì)周圍的關(guān)節(jié)滑膜進(jìn)一步造成破壞，從而加快 RA 的病程發(fā)展。因此，抑制血管生成是早期預(yù)防和治療 RA 的重要策略之一。

正常的關(guān)節(jié)滑膜有 1～3 層細(xì)胞，主要分為兩類：滑膜巨噬細(xì)胞和滑膜成纖維細(xì)胞。在 RA 發(fā)病前期，滑膜增生至 8～10 層[10-11]。滑膜巨噬細(xì)胞和滑膜成纖維細(xì)胞被認(rèn)為是促炎細(xì)胞因子、趨化因子和酶的主要來源，起到降解滑膜內(nèi)結(jié)締組織及破壞關(guān)節(jié)軟骨的作用[12]?；ぞ奘杉?xì)胞靜息階段表型為 MΦ，但在不同微環(huán)境下，MΦ 可由靜息階段極化為 M1 型或 M2 型[13]。在脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)或促炎因子，如干擾素-γ(Gamma-Interferon，IFN-γ)和腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)的刺激下，MΦ 被激活為 M1 型巨噬細(xì)胞。M1 型巨噬細(xì)胞主要通過產(chǎn)生白細(xì)胞介素-6(Interlekin6，IL-6)、白細(xì)胞介素-1β(Interlekin1β，IL-1β)和腫瘤壞死因子促進(jìn)炎癥的發(fā)展。另外，MΦ 在白細(xì)胞介素-4、白細(xì)胞介素-10、白細(xì)胞介素-13 等因子的刺激下極化為 M2 型巨噬細(xì)胞，此表型主要在炎癥消除、血管生成和組織修復(fù)中發(fā)揮作用。然而，在 RA 患者組織樣本中發(fā)現(xiàn) M1/M2 比率明顯升高[14]。

炎性白細(xì)胞的遷移和炎癥因子的浸潤，特別是隨著 TNF-α 和 IL-1β 的大量產(chǎn)生，導(dǎo)致破骨細(xì)胞功能增強(qiáng)，滑膜成纖維細(xì)胞向高度遷移和強(qiáng)破壞性的表型轉(zhuǎn)化[15]?；こ衫w維細(xì)胞激活后不僅產(chǎn)生具有促炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子，還產(chǎn)生具有促血管生成作用的因子，其中包括白細(xì)胞介素-8(Interlekin 8，IL-8)、血管生成素-1 和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子[16]。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的主要作用是促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)血管新生，在白細(xì)胞介素-1 和 TNF-α 的作用下，其促血管新生的作用會(huì)得到進(jìn)一步增強(qiáng)。此外，血管生成素-1 與血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子在血管新生中起協(xié)同效應(yīng)，具有促進(jìn)血管發(fā)芽和提高血管通透性的作用[17]。然而，滑膜巨噬細(xì)胞和滑膜成纖維細(xì)胞之間是如何相互影響的？又是如何對(duì)血管生成產(chǎn)生促進(jìn)作用的？這些問題對(duì)于揭示 RA 的病理過程及體外構(gòu)建 RA 血管翳病理類組織模型具有重要意義，同時(shí)也是本文的研究重點(diǎn)。

目前血管新生的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭饕譃閮煞N，體外細(xì)胞培養(yǎng)和體內(nèi)動(dòng)物模型。由于動(dòng)物模型建模時(shí)間長且難度較大，故藥物的初篩主要采用體外細(xì)胞培養(yǎng)。血管內(nèi)皮細(xì)胞在 RA 血管新生的過程中受到巨噬細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞的刺激，所以單純采用內(nèi)皮細(xì)胞較難完整復(fù)制體內(nèi)復(fù)雜的過程[18]。因此，通過多種細(xì)胞的聯(lián)合培養(yǎng)模擬體內(nèi)血管生成過程是一種更好的方法。黃歡[19]采用 Transwell 方法，研究染料木素對(duì)細(xì)胞共培養(yǎng)體系的血管抑制作用。Blasioli 等[20]的研究表明在含三維軟骨成分下，單核細(xì)胞與滑膜細(xì)胞共培養(yǎng)可產(chǎn)生細(xì)胞因子、降解酶、基質(zhì)金屬蛋白酶-1 和基質(zhì)金屬蛋白酶-3，利用細(xì)胞間的相互作用可體外模擬骨關(guān)節(jié)炎疾病環(huán)境，建立早期骨關(guān)節(jié)炎軟骨降解模型。另外，有研究表明在未對(duì) RA 患者滑膜進(jìn)行酶切的情況下可獲得炎癥細(xì)胞群體，以此混合培養(yǎng)構(gòu)建血管翳模型，在此基礎(chǔ)上可研究白細(xì)胞介素-17 在血管翳與破骨細(xì)胞中的雙向作用[21]。

由于在 RA 增生的滑膜血管翳中，M1 型巨噬細(xì)胞大量釋放促炎癥因子，因此其對(duì)于滑膜成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞而言是重要的病理進(jìn)展推手。然而，目前相關(guān)的研究和機(jī)理仍然不清楚，這會(huì)阻礙后續(xù)對(duì)模擬血管翳病理類組織的體外構(gòu)建，因此有必要對(duì)該問題進(jìn)行前期探討?；诖耍狙芯坎捎萌怂柘蛋籽魏思?xì)胞(THP-1)源 M1 型巨噬細(xì)胞上清液進(jìn)行研究。具體地，采用酶聯(lián)免疫吸附測定方法檢測 M1 型巨噬細(xì)胞上清液炎癥因子的蛋白含量；采用 CCK8 試劑盒檢測 THP-1 源 M1 型巨噬細(xì)胞上清液對(duì)促進(jìn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞(MH7A)、人臍靜脈細(xì)胞融合細(xì)胞(EA.hy926)的增殖作用。通過本研究，初步探討了 M1 型巨噬細(xì)胞對(duì)滑膜巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的影響，也為下一步體外建立 RA 血管翳模型提供前期數(shù)據(jù)支持。

2 材料和方法

2.1 材料

THP-1 細(xì)胞獲贈(zèng)于深圳大學(xué)陳心春教授課題組，人 RA 成纖維細(xì)胞 MH7A 購于 Riken 細(xì)胞庫，人血管內(nèi)皮細(xì)胞 EA.hy926 獲贈(zèng)于香港中文大學(xué)秦嶺教授課題組；細(xì)胞培養(yǎng)基 DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium)、RPMI(Roswell Park Memorial Institute)，磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline，PBS)，青霉素-鏈霉素混合雙抗均購于美國 Hyclone 公司；胎牛血清購于美國 Gibco 公司；胰酶購于美國 Invitrogen 公司；佛波酯(Phorbol 12-Myristate 13-acetate，PMA)獲贈(zèng)于中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院李亮課題組；LPS 購于美國 Sigma-Aldrich 公司；IFN-γ 購于中國 Sinobiologial 公司；CCK8 細(xì)胞增殖與毒性檢測試劑盒購于日本 Dojindo 公司；酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8)購于美國 R&D 公司。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

本實(shí)驗(yàn)的 THP-1 細(xì)胞、MH7A 細(xì)胞均采用 RPMI 完全培養(yǎng)基(含 10% 血清和 1% 青鏈霉素混合雙抗)進(jìn)行培養(yǎng)，EA.hy926 細(xì)胞采用 DMEM 完全培養(yǎng)基(含 10% 血清和 1% 青鏈霉素混合雙抗)進(jìn)行培養(yǎng)。其中，細(xì)胞培養(yǎng)箱環(huán)境為 37 ℃、 5% CO2。

2.2.2 THP-1 誘導(dǎo) M1 型巨噬細(xì)胞的分型實(shí)驗(yàn)

THP-1 細(xì)胞狀態(tài)良好且密度達(dá) 80% 時(shí)，取部分用于細(xì)胞計(jì)數(shù)后，將剩余細(xì)胞懸液離心(1 000 r/min、5 min)后，棄上層培養(yǎng)基并輕輕彈散細(xì)胞(避免細(xì)胞抱團(tuán))，調(diào)整種板密度為 3.5×105個(gè)/mL，同時(shí)加入 100 ng/mL PMA，移液槍混勻后等體積分到相應(yīng)培養(yǎng)皿中，隨后置于培養(yǎng)箱內(nèi)。PMA 作用 48 h 后使其誘導(dǎo)分化為 MΦ 型細(xì)胞，PBS 清洗三遍，加入新鮮 RPMI 培養(yǎng)基(無血清)過夜。次日用 RPMI 完全培養(yǎng)基配制 100 ng/mL LPS 和 20 ng/mL IFN-γ 并替換細(xì)胞培養(yǎng)液，作用 24 h 后轉(zhuǎn)為 M1 型巨噬細(xì)胞，用 PBS 清洗兩遍，更換為 RPMI 培養(yǎng)基(無血清)培養(yǎng) 24 h，收集 THP-1 源巨噬細(xì)胞及其上清液。

2.2.3 引物合成

所用引物委托華大基因科技有限公司合成，具體引物序列如表 1 所示。

2.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量法

為檢測 MΦ 型和 M1 型巨噬細(xì)胞中 IL-8、eNOS 基因在 mRNA 水平上的含量變化，誘導(dǎo) THP-1 成為 MΦ 型后，加入新鮮 RPMI 完全培養(yǎng)基過夜。接著，M0 組用 RPMI 完全培養(yǎng)基替換原本培養(yǎng)基作用 24 h；M1 組用 RPMI 完全培養(yǎng)基配制 100 ng/mL LPS 和 20 ng/mL IFN-γ 并替換細(xì)胞培養(yǎng)液作用 24 h。此后，兩組均換為 RPMI 培養(yǎng)基(無血清)培養(yǎng) 24 h。接著，按照 RNA 提取試劑盒說明書提取總 RNA，同時(shí)采用紫外分光光度計(jì)定量各 mRNA 濃度并進(jìn)行 RNA 逆轉(zhuǎn)錄。其中，逆轉(zhuǎn)錄程序?yàn)椋?7 ℃，15 min；85 ℃，5 s；4 ℃，∞。逆轉(zhuǎn)錄完成后得到 cDNA，將其與上下游引物等反應(yīng)液混勻充分后，離心去除氣泡，使用熒光定量 PCR 儀器進(jìn)行檢測。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

2.2.5 酶聯(lián)免疫吸附測定

為檢測 M1 型巨噬細(xì)胞上清液中 IL-1β、TNF-α、IL-6 以及 IL-8 的蛋白含量。將收集到的 M1 型巨噬細(xì)胞上清液吸取到 1.5 mL 小型離心管(Eppendorf)中進(jìn)行離心(3 000 r/min、20 min)，離心結(jié)束后將上層液體轉(zhuǎn)入新的離心管中；隨后按說明書配制標(biāo)準(zhǔn)液，將樣品加到酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒專用的 96 孔板中，孵育，清洗。接著加入抗體結(jié)合液后再次孵育，清洗，加入顯色液，避光孵育，隨即加入終止液。充分混勻后采用紫外分光光度計(jì)在 450 nm 和 540 nm 波長處測量樣品吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計(jì)算出各因子的蛋白含量。

2.2.6 CCK8 細(xì)胞增殖與毒性實(shí)驗(yàn)

為檢測 M1 型巨噬細(xì)胞上清液對(duì) MH7A、EA.hy926 的增殖與毒性作用，將 MH7A 細(xì)胞(密度為 5 000 個(gè)/孔)、EA.hy926 細(xì)胞(密度為 3 000 個(gè)/孔)分別接種于 96 孔板。其中，收集 M1 型巨噬細(xì)胞上清為實(shí)驗(yàn)組；將不加處理的無血清 RPMI 作為對(duì)照組，并以此作為條件培養(yǎng)基。對(duì)于 MH7A 細(xì)胞而言，對(duì)照組培養(yǎng)基使用 RPMI(無血清)與 RPMI 完全培養(yǎng)基混合，比例分別為 5∶5、6∶4 和 7∶3；實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基使用 M1 型巨噬細(xì)胞上清液與 RPMI 完全培養(yǎng)基混合，比例對(duì)應(yīng)為 5∶5、6∶4 和 7∶3。經(jīng)過恒溫培養(yǎng)箱分別培養(yǎng) 24 h、48 h 和 72 h 后，每孔加入 10% 培養(yǎng)基體積的 CCK8，37 ℃ 孵育 2 h。孵育完成后，使用紫外分光光度計(jì)在 450 nm 波長下測量吸光值，利用細(xì)胞活力公式計(jì)算增殖與毒性值。

對(duì)于 EA.hy926 細(xì)胞而言，對(duì)照組培養(yǎng)基使用 RPMI(無血清)與 DMEM 完全培養(yǎng)基混合，比例分別為 5∶5、6∶4 和 7∶3；實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基使用 M1 型巨噬細(xì)胞上清液與 DMEM 完全培養(yǎng)基混合，比例對(duì)應(yīng)為 5∶5、6∶4 和 7∶3，分別作用 24 h、48 h、72 h 進(jìn)行 CCK8 測試，并根據(jù)公式對(duì)相應(yīng)指標(biāo)進(jìn)行計(jì)算。

2.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

首先，對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量法、酶聯(lián)免疫吸附測定、CCK8 實(shí)驗(yàn)獲得的初步數(shù)據(jù)使用 Excel 進(jìn)行公式計(jì)算；然后，使用 SPSS17.0 軟件對(duì)所有組內(nèi)及組間數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。其中，所有數(shù)值均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差”表示；采用單因素方差分析和雙因素方差分析了解各組數(shù)據(jù)間是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。當(dāng) P＜0.05 時(shí)，認(rèn)為兩組數(shù)據(jù)間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；當(dāng) P＜0.01 時(shí)，認(rèn)為兩組數(shù)據(jù)間具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；當(dāng) P＜0.001 時(shí)，認(rèn)為兩組數(shù)據(jù)間具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 THP-1 細(xì)胞誘導(dǎo)的 M1 型巨噬細(xì)胞的形態(tài)變化

光學(xué)顯微鏡下觀察 THP-1 細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)細(xì)胞形態(tài)呈圓形，大小均一，為單個(gè)懸浮細(xì)胞(圖 1(a))；經(jīng) 100 ng/mL PMA 誘導(dǎo) 48 h 后，部分細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，呈長梭型，且貼壁牢固，細(xì)胞團(tuán)聚生長，此時(shí)誘導(dǎo)分化成的細(xì)胞為 THP-1-MΦ 型(圖 1(b))。靜息過夜后，加入 LPS、IFN-γ 誘導(dǎo) 6 h，細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)細(xì)長狀，且細(xì)胞膜突起更為明顯，此時(shí)誘導(dǎo)分化成的細(xì)胞為 THP-1-M1 型(圖 1(c))。LPS、IFN-γ 誘導(dǎo) 24 h，圓形或橢圓形細(xì)胞脫落較多，此時(shí)誘導(dǎo)分化成的細(xì)胞也為 THP-1-M1 型，但單個(gè)細(xì)胞突起較 6 h 更多(圖 1(d))。

3.2 RT-PCR 檢測 THP-1 源 MΦ 和 M1 型巨噬細(xì)胞中 IL-8、eNOS 的 mRNA 水平

巨噬細(xì)胞 MΦ 與經(jīng) 100 ng/mL LPS 和 20 ng/mL IFN-γ 誘導(dǎo) 24 h 的 M1 型巨噬細(xì)胞相比，兩者在 IL-8、eNOS 的 mRNA 水平上均有表達(dá)，但沒有顯著性差異(P＞0.05)(圖 2)。

3.3 酶聯(lián)免疫吸附測定檢測 THP-1 源巨噬細(xì)胞上清液中炎癥因子的蛋白含量

與同一時(shí)期收取的 M0 型細(xì)胞上清液相比，經(jīng) LPS＋I(xiàn)FN-γ 誘導(dǎo) 6 h 的 THP-1-M1 細(xì)胞上清液中 IL-1β、IL-8 含量顯著增多，其中 IL-1β 濃度增加了 3.61 倍，IL-8 增加了 2.84 倍；經(jīng) LPS＋I(xiàn)FN-γ 誘導(dǎo) 24 h 后，THP-1-M1 細(xì)胞上清液中 IL-1β、IL-8 含量較 M0 上清液中有所增多，IL-1β 濃度增加了 1.67 倍，IL-8 濃度增加了 2.1 倍，但顯著性差異較誘導(dǎo) 6 h 的小(圖 3)。另外，由于各組分泌 IL-6 及 TNF-α 水平較低，無法進(jìn)行比較(未顯示)。

圖1 THP-1 不同誘導(dǎo)階段的細(xì)胞形態(tài)(×20)Fig.1 Cell morphology of THP-1 in diあerent induction stages (×20)

圖2 RT-PCR 檢測 THP-1 源 MΦ 和 M1 型巨噬細(xì)胞 IL-8 與 eNOS 的表達(dá)量Fig.2 Expression of IL-8 and eNOS in MΦ and M1 macrophages derived from THP-1

圖3 酶聯(lián)免疫吸附測定檢測細(xì)胞上清中 IL-1β 和 IL-8 的蛋白含量Fig.3 The protein content of IL-1β and IL-8 was detected by ELISA

3.4 CCK8 檢測 M1 型巨噬細(xì)胞上清液對(duì) H7A、EA.hy926 細(xì)胞的增殖作用

在實(shí)驗(yàn)組中，條件培養(yǎng)基為 LPS＋I(xiàn)FN-γ 處理 THP-1 細(xì)胞 24 h 后 M1 型細(xì)胞的無血清 RPMI 上清液，對(duì)照組條件培養(yǎng)基為不加處理的無血清 RPMI 培養(yǎng)基。當(dāng)條件培養(yǎng)基與 RPMI 含血清培養(yǎng)基混合比例為 7∶3 作用 MH7A 細(xì)胞 48 h 時(shí)，M1 型巨噬細(xì)胞上清液組對(duì) MH7A 細(xì)胞的增殖作用明顯高于無血清 RPMI 組，細(xì)胞存活率較無血清 RPMI 組高 1.41 倍(P＜0.05)。另外，條件培養(yǎng)基與 DMEM 含血清培養(yǎng)基混合比例為 6∶4 和 7∶3 作用 EA.hy926 細(xì)胞 72 h 時(shí)，M1 巨噬細(xì)胞上清液組對(duì) EA.hy926 細(xì)胞的增殖作用明顯高于無血清 RPMI 組，細(xì)胞存活率較無血清 RPMI 組分別高 1.89 倍和 1.72 倍，且具有顯著性差異(圖 4)。

4 討論與分析

在 RA 中，細(xì)胞間的相互作用會(huì)影響藥物治療的效果。因此，闡明 RA 各類細(xì)胞的相互影響將有助于更好地建立 RA 血管翳模型，同時(shí)可以高效、低成本地進(jìn)行 RA 藥物的高通量篩選。本文從巨噬細(xì)胞的作用及其對(duì)成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖影響進(jìn)行研究，了解在滑膜增生血管翳中促炎的 M1 型巨噬細(xì)胞對(duì)另外兩種細(xì)胞的作用。同時(shí)對(duì) RA 病理血管翳類組織的構(gòu)建條件進(jìn)行了摸索，為后續(xù)體外篩選 RA 治療藥物提供支撐。本文初步探討的結(jié)果顯示：體外 THP-1 源 M1 型巨噬細(xì)胞主要分泌 IL-1β、IL-8 兩種炎癥因子，但低表達(dá) IL-6、TNF-α。CCK8 結(jié)果顯示，巨噬細(xì)胞上清液對(duì) MH7A 細(xì)胞促增殖作用不明顯，72 h 對(duì) EA.hy926 細(xì)胞的促增殖作用較顯著。

在 RA 中，TNF-α 能直接影響內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與分化，參與血管新生。此外，TNF-α 聯(lián)合 IL-1β、白細(xì)胞介素-17 刺激成纖維細(xì)胞產(chǎn)生血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，也可以間接促進(jìn)血管生成。IL-1β 雖然不直接參與血管新生，但可引起成纖維細(xì)胞中血管生成素-1、內(nèi)皮細(xì)胞 TEK 酪氨酸激酶和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的表達(dá)升高，進(jìn)而影響血管生成。IL-8 主要由巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分泌，通過結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞上 CXCR1 和 CXCR2 受體(A 類視紫紅質(zhì)樣 G 蛋白偶聯(lián)受體)，促進(jìn)血管生成[9]。Tu 等[22]認(rèn)為巨噬細(xì)胞與成纖維細(xì)胞在 RA 中存在細(xì)胞交流，巨噬細(xì)胞主要通過分泌 IL-1β 和 TNF-α 誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為“腫瘤”樣細(xì)胞；成纖維細(xì)胞通過分泌 IL-6、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子等細(xì)胞因子，促進(jìn)血管生成。由于 RA 滑膜巨噬細(xì)胞含量少且不易在體外長期培養(yǎng)，故本文采用 PMA 誘導(dǎo) THP-1 單核細(xì)胞形成巨噬細(xì)胞的方法模擬巨噬細(xì)胞的作用。

圖4 CCK8 測定 THP-1 源 M1 巨噬細(xì)胞上清液對(duì) MH7A 和 EA.hy926 細(xì)胞的增殖作用Fig.4 CCK8 was used to determine the proliferation of MH7A and EA.hy926 cells by the supernatant of M1 macrophages derived from THP-1

酶聯(lián)蛋白吸附測定實(shí)驗(yàn)顯示，LPS 和 IFN-γ 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞 6 h、24 h 后，M1 型巨噬細(xì)胞上清液 IL-1β、IL-8 炎癥因子含量明顯增多。其中， LPS 和 IFN-γ 誘導(dǎo) 6 h 后，M1 上清液中 IL-1β 濃度增加了 3.61 倍，IL-8 增加了 2.84 倍；LPS 和 IFN-γ 誘導(dǎo) 24 h 后，M1 上清液中 IL-1β 濃度增加了 1.67 倍，IL-8 濃度增加了 2.1 倍。然而低表達(dá) IL-6、TNF-α。有文獻(xiàn)報(bào)道 M1 上清中含有 IL-6 和 TNF-α，此處不相符的原因可能是本文與其他文獻(xiàn)所用的 PMA、LPS 和 IFN-γ 濃度及作用時(shí)間不同[23-24]。在誘導(dǎo)過程中，PMA 誘導(dǎo) THP-1 分化為巨噬細(xì)胞，其使用量、誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)分化程度及功能的影響具有顯著性差異[25]。

在 CCK8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，M1 型巨噬細(xì)胞上清液與 RPMI 含血清培養(yǎng)基混合比例為 7∶3 作用 MH7A 細(xì)胞 48 h 時(shí)，細(xì)胞存活率較無血清 RPMI 組高 1.41 倍；M1 型巨噬細(xì)胞上清液與 DMEM 含血清培養(yǎng)基混合比例為 6∶4 和 7∶3 作用 EA.hy926 細(xì)胞 72 h 時(shí)，細(xì)胞存活率較無血清 RPMI 組分別高 1.89 倍和 1.72 倍。THP-1 源巨噬細(xì)胞上清液對(duì) MH7A、EA.hy926 細(xì)胞增殖無明顯作用，可能是由于 LPS 和 IFN-γ 誘導(dǎo) 24 h 時(shí)，M1 巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌量較少，如 IL-1β 蛋白含量約為 379 pg/mL，相較于研究常用的 10 ng/mL IL-1β，或 20 ng/mL TNF-α 的刺激量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足。另外，在本實(shí)驗(yàn)中，由于批次間細(xì)胞密度不完全一致導(dǎo)致炎癥因子濃度間的差異，因此 CCK8 結(jié)果不穩(wěn)定。但可以觀察到，24 h 時(shí) M1 上清液組與對(duì)照組無血清 RPMI 的細(xì)胞存活率間無明顯差異，而在 48 h、72 h、血清含量相同的情況下，THP-1 源 M1 型細(xì)胞無血清上清液對(duì)細(xì)胞的存活仍然起到一定的作用，初步確定了 THP-1 源 M1 型細(xì)胞分泌的因子對(duì) MH7A 和 EA.hy926 細(xì)胞具有增殖作用。由于 THP-1 源巨噬細(xì)胞與患者體內(nèi)病理環(huán)境下滑膜巨噬細(xì)胞存在差異，本研究僅初步探討了在 RA 增殖的滑膜中不同細(xì)胞間的相互作用。

Nozaki 等[26]表明從 RA 病患滑膜處收集細(xì)胞后直接進(jìn)行培養(yǎng)能夠構(gòu)建體外 RA 血管翳模型，雖然這種方法更貼合真實(shí)病理情況，但由于性別、發(fā)病程度等因素的不同，難以將模型標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)行 RA 藥物的高通量篩選。另外，Ibold 等[27]收集豬源軟骨細(xì)胞與 RA 源滑膜成纖維細(xì)胞在體外構(gòu)建血管翳模型，但更多著重于比較人工與機(jī)器操作的剪切力與準(zhǔn)確性。本文基于巨噬細(xì)胞對(duì)滑膜成纖維細(xì)胞的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)型作用，采用 THP-1 細(xì)胞系誘導(dǎo)形成的 M1 型巨噬細(xì)胞，體外研究 M1 型巨噬細(xì)胞對(duì)成纖維細(xì)胞 MH7A 的刺激作用及血管內(nèi)皮細(xì)胞 EA.hy926 的增殖作用。但本文也存在不足，如未檢測 M1 型巨噬細(xì)胞上清液對(duì) MH7A 中促血管因子在 mRNA、蛋白水平上的變化以及對(duì) EA.hy926 細(xì)胞遷移、成管腔能力的作用。因此，未來構(gòu)建類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎血管翳模型時(shí)需進(jìn)行進(jìn)一步探討。

5 結(jié) 論

本研究圍繞 THP-1 源 M1 巨噬細(xì)胞上清液是否促進(jìn) MH7A、EA.hy926 細(xì)胞增殖進(jìn)行探討。通過 PMA 誘導(dǎo) THP-1 細(xì)胞，經(jīng) LPS 和 IFN-γ 刺激 24 h，得到 M1 型巨噬細(xì)胞。酶聯(lián)免疫吸附測定檢測 M1 型巨噬細(xì)胞上清液主要含有 IL-1β、IL-8 蛋白。將 M1 型巨噬細(xì)胞上清液與含血清培養(yǎng)基進(jìn)行不同比例混合發(fā)現(xiàn)，對(duì) MH7A 細(xì)胞而言，7∶3 的比例在 48 h 時(shí)能促進(jìn)細(xì)胞增殖；對(duì) EA.hy926 細(xì)胞而言，6∶4 和 7∶3 在 72 h 對(duì)細(xì)胞增殖更為明顯。以上研究數(shù)據(jù)提示，M1 巨噬細(xì)胞與 MH7A、EA.hy926 細(xì)胞存在相互作用，未來工作將以此作為基礎(chǔ)構(gòu)建類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎血管翳模型并應(yīng)用于 RA 藥物高通量篩選，以更高效地篩選安全有效的 RA 治療藥物。