彭立影，劉功良*，費(fèi)永濤，余潔瑜，劉銳，白衛(wèi)東，王莉嫦，賈愛娟

1(仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 輕工食品學(xué)院， 廣東 廣州，510225)2(廣州鷹金錢食品集團(tuán)有限公司，廣東 廣州，510655) 3(廣東美味鮮調(diào)味食品有限公司，廣東 中山，528437)

產(chǎn)酯酵母是一類可產(chǎn)酯類物質(zhì)的酵母菌。產(chǎn)酯酵母大多屬于漢遜酵母(Hansenula)，少數(shù)屬于球擬酵母屬(Torulopsis)，具有較強(qiáng)的氧化特性和產(chǎn)酯能力。產(chǎn)酯酵母在發(fā)酵過程中產(chǎn)生醇類、酯類、酸類、烷烴類、芳香烴類、酮類等，這些物質(zhì)含量各異，構(gòu)成了不同酵母菌的獨(dú)特發(fā)酵香氣，已應(yīng)用于白酒、葡萄酒及調(diào)味品等食品發(fā)酵行業(yè)中。

近年來，國內(nèi)外對產(chǎn)酯酵母酯類物質(zhì)的合成研究逐漸成為發(fā)酵食品行業(yè)的重要領(lǐng)域，產(chǎn)酯的關(guān)鍵基因和關(guān)鍵酶不斷被深入挖掘。深入研究產(chǎn)酯酵母的產(chǎn)酯機(jī)制，能更好提高產(chǎn)品的品質(zhì)，豐富產(chǎn)品口味。本文對國內(nèi)外產(chǎn)酯酵母篩選及其產(chǎn)酯合成關(guān)鍵酶進(jìn)行綜述，以期為食品發(fā)酵行業(yè)發(fā)酵菌株的選擇及合成酯類化合物提供一定的理論依據(jù)。

1 產(chǎn)酯酵母的種類

產(chǎn)酯酵母對發(fā)酵產(chǎn)品的風(fēng)味具有重要作用，可改善風(fēng)味、提質(zhì)增香。目前，國內(nèi)外已報(bào)道的高產(chǎn)酯酵母菌有魯氏接合酵母(Zygosaccharomyesrouxii)、異常畢赤酵母(Pichiaanomala)、馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)、扣囊復(fù)膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera)、異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)、葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniasporauvarum)等。

1.1 畢赤酵母屬

畢赤酵母屬(Pichia)又為漢遜酵母屬(Hansenula)。畢赤酵母是一類需氧性酵母，其細(xì)胞呈圓形或橢球形，多邊芽殖，每個(gè)子囊含有1～4個(gè)表面光滑的子囊孢子。畢赤酵母在有氧條件下，可利用葡萄糖等碳源高密度發(fā)酵，在白酒、葡萄酒中均有發(fā)現(xiàn)該類酵母可產(chǎn)酯類物質(zhì)，提高產(chǎn)品質(zhì)量。于洋等[1]將霞多麗葡萄中分離得到的發(fā)酵畢赤酵母(P.fermentans)YF-19進(jìn)行純種發(fā)酵，采用氣相色譜測定揮發(fā)性物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)該酵母產(chǎn)乙酸苯乙酯的能力最強(qiáng)。SYLVESTER等[2]篩選出17種非釀酒酵母并將其應(yīng)用于啤酒發(fā)酵第1階段產(chǎn)生風(fēng)味酯和酚類化合物，發(fā)現(xiàn)畢赤酵母(P.kluyverii)可增加乙酸異戊酯(水果味、香蕉味)，且所有的畢赤酵母屬菌株可產(chǎn)生高濃度的乙酸乙酯。ZHANG等[3]從大曲中篩選出1株畢赤酵母(P.manshurica)，并將其運(yùn)用于醋中發(fā)酵，顯著提高酸和酯的產(chǎn)量，使其具有濃郁的果味和濃郁的奶油和堅(jiān)果味，從而提高醋的品質(zhì)。陳嘉等[4]從傳統(tǒng)山西老陳醋中分離出1株畢赤酵母(P.scaptomyzae)，該菌株產(chǎn)乙酯類物質(zhì)含量高，且低產(chǎn)高級(jí)醇。畢赤酵母與釀酒酵母在白酒釀造中進(jìn)行混合發(fā)酵，可顯著增加乙酸乙酯的含量，改善白酒的風(fēng)味物質(zhì)含量。這些研究結(jié)果可說明，將畢赤酵母運(yùn)用于酒類發(fā)酵中可增加酒體中的酯類物質(zhì)，豐富產(chǎn)品風(fēng)味。

1.2 假絲酵母屬

假絲酵母屬(Candida)是一類通過出芽繁殖，可形成假菌絲、不產(chǎn)子囊孢子的酵母菌，其細(xì)胞形態(tài)呈球形、橢圓形、長條形等。假絲酵母發(fā)酵能力弱、可直接同化淀粉，在白酒、米酒、醬油、果酒中產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)。假絲酵母中可產(chǎn)酯類物質(zhì)的主要有間型假絲酵母(C.intermedia)、熱帶假絲酵母(C.tropicalis)、克魯斯氏念珠菌(C.krusei)、光滑假絲酵母(C.glabrata)等。平常假絲酵母(C.inconspicua) 菌株發(fā)酵蘋果汁，可產(chǎn)生多種酯類物質(zhì)，顯著改善蘋果汁發(fā)酵風(fēng)味[5]。假絲酵母因自身可合成甘油，對高鹽環(huán)境具有很強(qiáng)的耐受性。在醬油發(fā)酵后期，加入假絲酵母可顯著提高醬油中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)如酯類、醇類等。馮杰[6]研究了耐高鹽增香酵母——埃切假絲酵母(C.etchellsii)CICIM Y0600的代謝特性，系統(tǒng)性分析了其在醬油中的增香作用，發(fā)現(xiàn)該菌株的添加可提高醬油中的4-乙基愈創(chuàng)木酚和HEMF等典型風(fēng)味物質(zhì)。

1.3 其他酵母菌

產(chǎn)香酵母的類群多，目前在發(fā)酵行業(yè)中已有應(yīng)用的有數(shù)十種。醬油發(fā)酵中，其產(chǎn)香酵母主要為魯氏接合酵母(Z.rouxii)和球擬酵母(Torulopsis)，具有優(yōu)良的耐鹽性能，對醬油特殊風(fēng)味的形成具有重要的作用。球擬酵母屬在醬香型白酒中已被廣泛應(yīng)用，且該類酵母的酯分解能力低，有利于酯類物質(zhì)的合成?？勰覐?fù)膜酵母(S.fibuligera)和多株伯頓絲孢畢赤酵母(Hyphopichiaburtonii)在醬香型白酒固態(tài)發(fā)酵中可產(chǎn)大量的酯類和醇類等[7]。產(chǎn)酯酵母在酒類行業(yè)的應(yīng)用，可以增酯降醇，提升酒的質(zhì)量。酵母在發(fā)酵過程中，可通過代謝和自溶，參與風(fēng)味物質(zhì)的生成，豐富了酒體的香氣，如有孢漢遜酵母(H.uvarum)、魯氏接合酵母(Z.rouxii)等。葡萄中存在不同種類的產(chǎn)酯酵母，如耐熱克魯維氏酵母(Kluyveromycesthermotolerans)、漢遜酵母(H.guilliermondii、H.evarum)、東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)等。由以上研究可知，產(chǎn)酯酵母對發(fā)酵食品的香氣成分具有巨大的貢獻(xiàn)。產(chǎn)酯酵母種類增加，可改善發(fā)酵食品的風(fēng)味。

2 產(chǎn)酯酵母的選育

2.1 產(chǎn)酯酵母產(chǎn)酯能力的檢測

產(chǎn)酯酵母所產(chǎn)酯類物質(zhì)的種類較多，在初篩或選育過程中，通常以總酯含量為檢測指標(biāo)。篩選產(chǎn)酯酵母總酯測定中，指示劑法有皂化中和法、靜置皂化法和微波皂化法。陸振群[8]利用皂化中和法測定發(fā)酵的豆芽汁培養(yǎng)基中總酯含量，從酒曲中篩選出1株高產(chǎn)酯酵母S8。待測溶液的顏色及渾濁程度對常規(guī)方法終點(diǎn)的判斷具有較大的干擾，電位滴定法是通過電位pH值確定滴定終點(diǎn)，可避免此缺點(diǎn)。楊盛春等[9]采用自動(dòng)電位滴定法測定3類6種酒中總酸與總酯的含量，對比國標(biāo)法測定結(jié)果吻合度較好。該方法不僅操作簡便，且精密度和準(zhǔn)確度較好。

在分析測定還原糖類較高的酒類總酯含量中，還原糖對總酯的測定具有較強(qiáng)的干擾。在堿性條件和水浴加熱下，葡萄糖會(huì)發(fā)生歧化、羥醛縮合等反應(yīng)生成葡萄糖酸等羧基化合物，消耗一定的NaOH，從而影響總酯的測定[10]。同時(shí)，葡萄糖在強(qiáng)堿性條件下形成雙鍵，在不同位置的烯醇式雙鍵與碳鏈斷裂分解為醛，醛聚合生成樹脂狀物質(zhì)(羥醛縮合反應(yīng))使溶液變黃，從而影響指示終點(diǎn)的判斷。微波皂化法在白酒和陳醋總酯測定中的應(yīng)用已有相關(guān)報(bào)道。在微波作用下，發(fā)酵液中的酯類物質(zhì)與堿的皂化反應(yīng)在溫度較低(<65 ℃)的條件下也可進(jìn)行。微波的快速熱效應(yīng)可加快皂化反應(yīng)，高效測定總酯含量。

指示劑法測定總酯較為繁瑣，在檢測大批樣品時(shí)，需耗費(fèi)大量的時(shí)間和水電資源用于回流。氣相色譜法可減少工作量，降低能耗，但其定量酯需要各種標(biāo)樣定量。劉千等[11]采用氣相色譜法測定229份原酒中4種主要乙酯含量的同時(shí)，計(jì)算樣品中總酯含量。結(jié)果表明，對比GB/T 10345—2007標(biāo)準(zhǔn)測定方法，測定的總酯含量無明顯差異；該方法具有快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。

表1 總酯測定方法優(yōu)缺點(diǎn)Table 1 The advantages and disadvantages of total ester determination method

2.2 自然選育

從酒曲、酒醪、醬油、豆瓣醬等傳統(tǒng)發(fā)酵食品中可篩選產(chǎn)酯效果好的野生型菌株。從自然界微生物中篩選理想菌種的主要步驟為采集菌樣→富集培養(yǎng)→純種分離→性能鑒定。羅小葉等[17]通過可培養(yǎng)方法從醬香大曲中分離出1株主產(chǎn)果香味的酵母菌株，對其進(jìn)行菌種鑒定生理生化特性分析，確定該菌株為扣囊復(fù)膜酵母(S.fibuligera)。ZHANG等[3]用孟加拉紅培養(yǎng)基從大曲固態(tài)發(fā)酵酒醅中分離出19株酵母菌，通過產(chǎn)酯發(fā)酵培養(yǎng)基篩選出1株高產(chǎn)酯酵母菌株Y14，鑒定為盔狀畢赤酵母(P.galeiformis)。以Y14強(qiáng)化大曲為發(fā)酵劑，在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模發(fā)酵的蒸餾酒及醋具有濃郁的香氣及悠長的口感。由于酯類物質(zhì)極不穩(wěn)定，蒸發(fā)快，GARAVAGLIA等[18]提出了一種簡便、高效、快速的頂空-固相萃取法直接從萃取瓶中快速篩選產(chǎn)酯酵母。由于自然突變頻率低，僅靠自然選育對于篩選優(yōu)勢菌種具有很大的局限性，這限制了產(chǎn)酯酵母的來源和使用。

2.3 誘變育種

誘變育種是微生物育種的主要方法之一，也是選育大多數(shù)優(yōu)良高產(chǎn)菌株的首選方法。李銳利[19]采用原生質(zhì)體紫外、化學(xué)、復(fù)合及再生誘變育種手段，對酒曲中分離篩選出的高產(chǎn)乙酸乙酯酵母菌株進(jìn)行改造，提高了其產(chǎn)酯性能和耐溫性能。陸振群[8]采用紫外照射，對酒曲中篩選得到的1株高產(chǎn)酯酵母S8，通過杜氏發(fā)酵管產(chǎn)CO2體積及發(fā)酵總酯測定篩選得1株優(yōu)良菌株Y16，其發(fā)酵產(chǎn)總酯量可達(dá)3.21 g/L，誘變后產(chǎn)酯總量提高了75.28%。王春玲等[20]采用紫外及甲基磺酸乙酯誘變和原生質(zhì)體融合篩選出1株耐鹽性(質(zhì)量濃度>180 g/L)釀酒酵母，有效提高了乙酸乙酯、乙醇、乳酸乙酯等風(fēng)味物質(zhì)的含量。盡管誘變育種可提高基因突變頻率，但長期使用誘變劑處理菌株，會(huì)使菌株產(chǎn)生“疲勞效應(yīng)”，同時(shí)影響菌種的生長代謝，不利于食品的發(fā)酵。

2.4 原生質(zhì)體融合育種

原生質(zhì)體融合是將遺傳性狀不同的2個(gè)細(xì)胞的原生質(zhì)體進(jìn)行融合, 以獲得兼有雙親遺傳性狀的穩(wěn)定重組子的過程。采用原生質(zhì)體融合技術(shù)將性狀優(yōu)良的菌種進(jìn)行融合，從而獲得性狀更好的菌株，是選育優(yōu)良菌種的新途徑。YE等[21]以蘋果酒中分離出的克魯斯氏念珠菌(C.krusei)PF14和釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)WF1為親本菌株，通過超聲波處理制備原生質(zhì)體，紫外滅活法和熱滅活法使原生質(zhì)體失活，利用原生質(zhì)體電融合構(gòu)建了新的酵母雜交菌株R4，該菌株可用于發(fā)酵蘋果汁，改善蘋果酒的香氣及風(fēng)味多樣性。林小江等[22]將低產(chǎn)甲醇釀酒酵母(S.cerevisiae)滅活的雙親單倍體原生質(zhì)體與生香酵母進(jìn)行融合，得到1株低甲醇與高產(chǎn)酯的釀酒酵母融合菌株。原生質(zhì)體融合雖可突破種屬限制，但所獲得的融合子的遺傳穩(wěn)定性較差，常發(fā)生分離回復(fù)的現(xiàn)象，導(dǎo)致性能退化，并且原生質(zhì)體融合后DNA交換和重組隨機(jī)發(fā)生，缺乏遺傳標(biāo)記，增加了重組體分離篩選難度。

2.5 基因工程育種

隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)的發(fā)展，利用基因工程選育具有優(yōu)良性狀的菌株已取得較大的進(jìn)展。過表達(dá)產(chǎn)酯基因及敲除水解酶基因，可提高酯的生成。葛峻伶等[23]發(fā)現(xiàn)，敲除BAT2基因的同時(shí)過表達(dá)Lg-ATF1基因的重組菌株S5-Lg與親本菌株相比，乙酸乙酯生成量提高了26.81%，同時(shí)，異丁醇和異戊醇皆下降近10%。CRISPR-Cas系統(tǒng)是操作細(xì)菌、酵母和人類細(xì)胞基因組簡單高效方法的基礎(chǔ)。L?BS等[24]通過設(shè)計(jì)RNA聚合酶Ⅲ雜合啟動(dòng)子，將釀膿鏈球(Streptococcuspyogenes)中的CRISPR-Cas9系統(tǒng)應(yīng)用于馬克斯克魯維酵母(K.marxianus)，影響酵母菌細(xì)胞中乙酸乙酯和乙醇的合成。CRISPR-Cas9是一種RNA引導(dǎo)的DNA核酸內(nèi)切酶，它利用RNA-DNA堿基配對來靶向外源目標(biāo)基因。然而，CRISPR-Cas9系統(tǒng)的主要局限在于脫靶效應(yīng)。為解決該問題，LI等[25]采用核酸內(nèi)切酶I-SCEI的表達(dá)，建立了一個(gè)快速高效的系統(tǒng)，加快了白酒釀酒酵母無縫缺失的進(jìn)度和效率。該研究在TEF1啟動(dòng)子控制下過表達(dá)PTEF1-ATF1-TPGK1基因片段中的ATF1基因，并將該片段插入氨基酸轉(zhuǎn)氨酶中BAT2基因缺失的菌株中，構(gòu)建BAT2基因缺失、ATF1基因過表達(dá)酵母菌Hα5。通過與親本菌株比較，菌株Hα5乙酸乙酯濃度高出34.84倍。基因工程育種技術(shù)操作方法復(fù)雜，設(shè)備昂貴，且外源基因的安全性一直備受爭議，但基因工程育種存在多方面的優(yōu)勢，如定向性明確，遺傳穩(wěn)定，基因工程改造可為選育產(chǎn)酯優(yōu)良的酵母和改善發(fā)酵食品風(fēng)味提供一定思路和參考。

3 酵母菌產(chǎn)酯的關(guān)鍵酶

酯類物質(zhì)合成主要通過3個(gè)途徑，包括酯化反應(yīng)途徑、醇?；D(zhuǎn)移酶途徑和醇脫氫酶途徑。非釀酒酵母可生成多種醇類、醛類和酯類等香味物質(zhì)。深入研究產(chǎn)酯酵母的產(chǎn)酯關(guān)鍵酶，有助于更好地闡述產(chǎn)酯酵母機(jī)制并促使其應(yīng)用。目前，普遍認(rèn)為是酵母菌在發(fā)酵過程中利用葡萄糖，經(jīng)糖酵解(embden-meyerhof-parnas-pathway，EMP)途徑代謝生成乙醇和乙酸，而后在酯酶的作用下生成乙酸乙酯。酵母胞內(nèi)酶和胞外酶都具有酯化能力，且在酯化過程中，酵母可以通過酯酶的逆反應(yīng)生成酯類物質(zhì)。酒類中的酯類物質(zhì)主要分為兩大類，一類是乙酸酯，主要由醇乙?；D(zhuǎn)移酶(alcohol-O-acetyltransferase)催化底物乙酰輔酶A和乙醇生成；一類是脂肪酸乙酯，主要由醇?；D(zhuǎn)移酶催化相應(yīng)的?；o酶A和乙醇合成。在白酒釀造微生物中，乙酸乙酯的生成主要由底物乙酰輔酶A(acetyl coenzyme A，acetyl-CoA)、乙醇濃度和醇乙?；D(zhuǎn)移酶活性決定。酯類物質(zhì)合成途徑如圖1所示。

圖1 酯生成途徑Fig.1 The formation pathway of esters

3.1 乙酰輔酶A

釀酒酵母細(xì)胞中，乙酰輔酶A是含量最豐富的?；o酶A，分布于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、線粒體、過氧化物酶體等不同的亞細(xì)胞區(qū)域。丙酮酸代謝支路(pyruvate dehydrogenase,PDH旁路途經(jīng))是乙酰輔酶A主要形成途徑，其次在線粒體中經(jīng)丙酮酸脫氫酶途徑形成，少部分由ATP直接激活乙酸經(jīng)轉(zhuǎn)?；感纬?。在PDH旁路途徑中，乙酰輔酶A合成酶(acetyl coenzyme A synthetase，ACS)是合成乙酰輔酶A的關(guān)鍵酶，由基因ACS1和ACS2編碼。ACS1對酵母細(xì)胞中以非葡萄糖為碳源的代謝具有重要作用，缺氧和高濃度葡萄糖可抑制其表達(dá)；ACS2是釀酒酵母利用葡萄糖為碳源進(jìn)行生長和繁殖所必需的基因[26]。釀酒酵母細(xì)胞中，過表達(dá)ACS1和ACS2可提高乙酰輔酶A含量。

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，泛酸激酶(pantothenate kinase，panK)中的pank基因也可促進(jìn)酯類物質(zhì)的生成。泛酸激酶是輔酶A生物合成途徑中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶，同時(shí)補(bǔ)充輔酶A前體泛酸，使得細(xì)胞內(nèi)輔酶A和乙酰輔酶A水平升高。VADALI等[27]在此基礎(chǔ)上，研究發(fā)現(xiàn)同時(shí)過表達(dá)ATF2基因和pank基因比僅過表達(dá)ATF2基因的菌株產(chǎn)乙酸異戊酯含量多6倍。CAB2基因編碼磷酸泛酸半胱氨酸連接酶。在泛酸到輔酶A的代謝途徑中，CAB2基因的表達(dá)可影響輔酶A的合成。DONG等[28]構(gòu)建工程菌株，過表達(dá)基因CAB2、ACS2和ATF1，最后乙酸乙酯含量均有所提高。

乙酰輔酶A水解酶(acetyl coenzyme ahydrolase，ACH)由ACH1基因編碼，參與細(xì)胞內(nèi)acetyl-CoA的調(diào)節(jié)，催化acetyl-CoA水解為乙酸和HSCoA。鄭楠等[29]通過敲除ACH1基因降低acetyl-CoA的降解，過表達(dá)ACS1和ACS2基因得到工程菌株乙酸乙酯的生成量分別比親本菌株提高26.12%和23.70%。有研究報(bào)道，乙酰輔酶A水解酶在葡萄糖的環(huán)境下受到抑制。PLATA等[30]研究了葡萄糖和氧對釀酒酵母酒精發(fā)酵生產(chǎn)乙酸乙酯和乙酸異戊酯的影響，同時(shí)測定乙醇乙酰轉(zhuǎn)移酶和酯酶在體外的活性，發(fā)現(xiàn)葡萄糖濃度只影響AATase的最大活性，而氧對AATase的最大活性有輕微的抑制作用；酯酶僅在低或中等葡萄糖質(zhì)量濃度(50或100 g/L)下催化乙酸乙酯的合成，并在固定生長期對乙酸異戊酯達(dá)到最大水解活性，在葡萄糖質(zhì)量濃度為250 g/L和半?yún)捬鯒l件下，培養(yǎng)基中乙酸乙酯和乙酸異戊酯的質(zhì)量濃度最高。

乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACC)和脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)系統(tǒng)對脂肪酸乙酯的合成具有重要作用[31]。乙酰輔酶A羧化酶可將乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為丙二酸單酰輔酶A，脂肪酸合成酶復(fù)合體將乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A轉(zhuǎn)化為脂肪?；o酶。同時(shí)，乙酰輔酶A羧化酶是脂肪酸生物合成中的關(guān)鍵酶及限速酶，脂肪?；o酶可轉(zhuǎn)化為游離脂肪酸。研究表明，脂肪酸合成基因如ACC1、FAS1和FAS2在轉(zhuǎn)錄水平受肌醇介導(dǎo)的負(fù)調(diào)控基因OPI1所抑制。CHEN等[32]利用釀酒酵母代替霉菌、細(xì)菌和產(chǎn)香酵母來提高己酸乙酯的產(chǎn)量，過表達(dá)ACC1、FAS1和FAS2基因的同時(shí)缺失OPI1基因，構(gòu)建了3株重組菌株α5-ACC1ΔOPI1、α5-FAS1ΔOPI1和α5-FAS2ΔOPI1，發(fā)現(xiàn)重組菌株在濃香型白酒中能顯著提高己酸乙酯的產(chǎn)量，且重組菌株α5-FAS1ΔOPI1也能提高乙酰輔酶A的含量。

3.2 醇?；D(zhuǎn)移酶

醇酰基轉(zhuǎn)移酶(alcohol acyltransferase，AAT)的活性是酯類合成的決定性關(guān)鍵因素。醇乙?；D(zhuǎn)移酶主要由基因ATF1、ATF2和Lg-ATF1編碼，催化酵母中乙酰輔酶A和乙醇結(jié)合，生成乙酸酯。在acetyl-CoA含量增加的基礎(chǔ)上，增強(qiáng)醇乙?；D(zhuǎn)移酶的活性，可促進(jìn)乙酸乙酯的生成。研究表明，過表達(dá)ATF1基因可顯著提高乙酸乙酯的含量，且Lg-ATF1基因的作用弱于ATF1基因[33]。VERSTREPEN等[34]將實(shí)驗(yàn)室菌株及商業(yè)釀造菌株中敲除或過表達(dá)ATF1、Lg-ATF1和ATF2，通過頂空色譜和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對酯的形成進(jìn)行監(jiān)測，結(jié)果表明，ATF1和ATF2的表達(dá)水平對乙酸乙酯和乙酸異戊酯的形成有較大影響?；駻TF1和ATF2的表達(dá)可生成低揮發(fā)性酯如乙酸酯類，且基因ATF1和ATF2可調(diào)控其他醇酰基轉(zhuǎn)移酶活性。同時(shí)缺失ATF1和ATF2基因的菌株不形成乙酸異戊酯，表明編碼醇乙?；D(zhuǎn)移酶的ATF1和ATF2基因共同調(diào)控酵母細(xì)胞內(nèi)異戊醇轉(zhuǎn)移酶的活性。ATF1的活性還受蛋白激酶Sch9p和蛋白激酶A(protein kinase，PKA)的調(diào)控，參與應(yīng)激反應(yīng)和營養(yǎng)傳感信號(hào)通路[35-36]。

氨基酸是發(fā)酵中的重要原料。酵母中高級(jí)醇的生物合成是由支鏈氨基酸(branched-china amino acid,BCAA)代謝途徑中用于降解氨基酸的α-酮酸中間體合成。酵母中的BCAAs通過Ehrlich途徑的轉(zhuǎn)氨作用轉(zhuǎn)化為α-酮酸。支鏈氨基酸分解代謝的第一步和限速步驟分別由BAT1和BAT2編碼的線粒體和胞質(zhì)支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶催化。BAT2缺失對高級(jí)醇的形成有顯著影響。LI等[37]揭示了醇乙?；D(zhuǎn)移酶基因(Lg-ATF1、ATF2、ATF1)過表達(dá)與BAT2缺失的相互關(guān)系，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)ATF2且缺失BAT2的菌株可以顯著增加酯的生成和降低酒精濃度，過表達(dá)ATF1且缺失BAT2的菌株能更大程度上進(jìn)一步提高酯醇比，而Lg-ATF1過表達(dá)對酯和高級(jí)醇的生成沒有影響。

釀酒酵母中的EHT1和EEB1基因也可編碼醇酰基轉(zhuǎn)移酶，是合成中鏈脂肪酸乙酯的關(guān)鍵基因。李鋒等[38]對釀酒酵母醇己?；D(zhuǎn)移酶基因EHT1進(jìn)行了過表達(dá)，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)EHT1基因能提高釀酒酵母產(chǎn)酯性能，特別是對產(chǎn)己酸乙酯有顯著作用。KRUIS等[39]在酵母中發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的醇乙酰基轉(zhuǎn)移酶家族Eat1，該酶在所有產(chǎn)乙酸乙酯的酵母中都存在編碼基因序列，確定了Eat1是酵母合成乙酸乙酯的關(guān)鍵酶。在K.marxianus中，酯的合成可能是由乙醇與乙酰輔酶A通過ATF1活性縮合，也可能通過EAT活性縮合[23,40]。L?BS等[41]研究EAT1作為酯生物合成的主要生化途徑，并創(chuàng)建了一系列具有酯生物合成假定活性的基因敲除來確定和控制細(xì)胞內(nèi)的定位，發(fā)現(xiàn)敲除EAT1的菌株其乙酸乙酯的生物合成幾乎被消除，且乙酸異戊酯和乙酸苯乙酯的合成量減少了88%。SAERENS等[42]評(píng)估了EHT1和EEB1基因編碼的醇酰基轉(zhuǎn)移酶在體外的性能，發(fā)現(xiàn)對脂肪酸乙酯的合成及水解都具有酶活性。但通過構(gòu)建過表達(dá)EHT1和EEB1基因菌株，發(fā)現(xiàn)脂肪酸乙酯的合成并未顯著增加。SAERENS等[43]再次研究，發(fā)現(xiàn)乙酯水平的變化不能用EEB1表達(dá)水平的差異進(jìn)行解釋，并且中鏈脂肪酸乙酯合成的主要限制因素并不是合成酶的活性，而是脂肪酸前體的含量。

3.3 醇脫氫酶

醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase，ADH)是一類含鋅或含鐵的醇脫氫酶，可將醛或酮還原為醇，氧化半縮醛化合物，催化生物體內(nèi)醇代謝。半縮醛是由醇和醛混合物形成的，在半縮醛羥基被氧化后，形成酯，該反應(yīng)以NAD(P)+為氫受體。釀酒酵母ADH具有多種半縮醛脫氫酶活性，用于合成甲酸甲酯、甲酸乙酯、乙酸甲酯和乙酸乙酯。ADH產(chǎn)生酯的機(jī)理基于半縮醛與仲醇的結(jié)構(gòu)相似性，對體內(nèi)酯的產(chǎn)生具有重要作用。在釀酒酵母中編碼ADH的基因是adh1-adh7，ADH特異性決定了某些(高級(jí))醇可用于酯的形成。因此，ADH可能對酵母的產(chǎn)酯有間接且顯著的影響。

早有研究表明[44]，染色體中缺失基因ADH1、ADH2與缺失基因ADH1的釀酒酵母對比，前者酵母的乙酸乙酯生成量顯著降低，但敲除ADH2的菌株產(chǎn)生乙酸乙酯的積累量沒有變化?？梢?，基因ADH1可影響釀酒酵母中乙酸乙酯的合成。劉港等[45]用植物乳桿菌的乳酸脫氫酶基因ldhL1替換釀酒酵母丙酮酸脫羧酶基因PDC1構(gòu)建L-乳酸酵母菌株，顯著提高了乳酸乙酯的產(chǎn)量。YURIMOTO等[46]從波氏假絲酵母菌中克隆得到醇脫氫酶，由CbADH1、CbAdh2、CbAdh3基因編碼，并通過基因干擾實(shí)驗(yàn)表明波氏假絲酵母菌中甲酸甲酯的合成由胞質(zhì)基因ADH1控制。VANRIJSWIJCK等[47]研究Cyberlindenerafabianii65、P.kudriavzevii129和S.cerevisiae131體外醇脫氫酶和醇乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性，發(fā)現(xiàn)它們與酯的形成沒有相關(guān)性。相比之下，這3種酵母的乙酸酯水解酶活性與乙酸酯產(chǎn)量呈明顯的負(fù)相關(guān)。如何在酯的合成和水解中達(dá)到平衡，使得酯的凈積累量達(dá)到需要的目標(biāo)，是下一步研究的重點(diǎn)方向。

3.4 水解酶

酯在合成的過程中發(fā)生酯的水解。早有研究發(fā)現(xiàn)，由IAH1編碼的酶負(fù)責(zé)酯的水解。ATF1過表達(dá)和IAH1斷裂突變菌株可顯著提高黃酒中乙酸酯的含量，降低異戊醇的含量[48]。SCHNEIDERBANGER等[49]對德國小麥啤酒生產(chǎn)中最常用的5種小麥啤酒酵母菌株的乙酸酯生產(chǎn)能力進(jìn)行測定，探討小麥啤酒酵母在一次發(fā)酵過程中的基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)基因ATF1、ATF2和IAH1在初級(jí)發(fā)酵期間4 d內(nèi)的表達(dá)水平與乙酸酯的形成緊密相關(guān)。大多數(shù)酵母菌株在24～48 h 出現(xiàn)了ATF1的表達(dá)，酯的產(chǎn)量也在增加。在同一時(shí)期，乙酸異戊酯和乙酸乙酯合成的同時(shí)也發(fā)生降解，IAH1的表達(dá)也在增加。IAH1在N-末端附近具有明顯的GDSL序列模體和4個(gè)保守的序列塊，這是SGNH水解酶的一個(gè)特征，SGNH水解酶是水解酶/脂解酶的一個(gè)亞家族。IAH1的晶體結(jié)構(gòu)在其催化三聯(lián)體中有一個(gè)Ser12/Asp187/His190序列和2個(gè)殘基，即Gly53和Asn83，它們充當(dāng)穩(wěn)定反應(yīng)中間體的氧陰離子孔。Ser12位于b1末端的拓?fù)溟_關(guān)點(diǎn)，是親核分子和氧陰離子空穴的第3個(gè)質(zhì)子供體。His190作為一個(gè)堿基，通過去質(zhì)子化羥基使活性位點(diǎn)Ser12更親核。這一結(jié)構(gòu)特征符合SGNH水解酶的親核/酸/His規(guī)律。MA等[50]確定了由IAH1基因編碼的酶的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)在底物結(jié)合區(qū)有一個(gè)額外的C-末端參與了同二聚體的形成，這種額外的C-末端限制了活性位點(diǎn)的進(jìn)入，并且在確定底物特異性方面起著重要作用?？梢?，C-末端的缺失提供了更好的途徑進(jìn)入酶的活性位點(diǎn)，使得它能夠容納更長的?；?。

4 結(jié)論與展望

非釀酒酵母主要產(chǎn)香、產(chǎn)酯等香味物質(zhì)，對于改善白酒、啤酒、醬油等發(fā)酵食品的風(fēng)味具有重要作用。酵母本身理化性質(zhì)存在一定差異，在不同的環(huán)境中會(huì)呈現(xiàn)不同的特點(diǎn)，可篩選出具有特殊能力的產(chǎn)香酵母，應(yīng)用于發(fā)酵食品、調(diào)味品等領(lǐng)域中。研究酵母菌的產(chǎn)酯過程及關(guān)鍵酶可為菌株選育及發(fā)酵食品風(fēng)味的改善提供借鑒依據(jù)。在后續(xù)的研究工作中，一方面可進(jìn)一步探究編碼酯類合成關(guān)鍵酶的其他基因。另一方面，可將酯類物質(zhì)合成中編碼關(guān)鍵酶的基因整合到其他菌株基因組中，構(gòu)建新的發(fā)酵菌株，從而提高酯類物質(zhì)的含量。多項(xiàng)研究表明乙酸酯的合成很大程度取決于ATF1和ATF2的表達(dá)，影響其表達(dá)的細(xì)胞因子都是調(diào)節(jié)乙酸酯合成的潛在靶點(diǎn)。同時(shí)，國內(nèi)外對酯類物質(zhì)的研究主要在于酯合成上，而在最終發(fā)酵產(chǎn)物中，對于酯水解的研究較少，如何在酯合成和水解之間找到平衡點(diǎn)，也是潛在的研究方向。