白 華，曹宏哲，劉鵬飛，周 帆，藏金萍，董金皋，張 康，邢繼紅

（河北省植物生理與分子病理學重點實驗室/河北農(nóng)業(yè)大學 真菌毒素與植物分子病理學實驗室，河北 保定 071000）

在植物中，MYB 轉錄因子超家族數(shù)量龐大且功能多樣，它們在不同組織和不同生理階段特異性表達，是植物發(fā)育、代謝和抗逆反應體系中的關鍵因子［1-2］。R2R3-MYB 型轉錄因子是MYB 轉錄因子超家族中數(shù)量最多的成員，其包含2 個保守MYB結構域，在植物初生和次生代謝、細胞形態(tài)建成、生長發(fā)育、抵抗生物和非生物脅迫中發(fā)揮重要作用［2-4］。R2R3-MYB 型轉錄因子中的一些蛋白能夠通過與TPL/TPRs（TOPLESS/TOPLESS-related proteins）蛋白互作，參與植物抗蟲、防御非生物脅迫和種子發(fā)育等多種過程［5］。

TPL/TPRs 蛋白是一類保守的植物轉錄輔抑制因子家族蛋白，包括TPL、TPR1、TPR2、TPR3 和TPR4。在植物中，TPL/TPRs 蛋白家族通過與乙烯反應因子相關的反應抑制基序（EAR motif）相互作用，參與調(diào)控植物生長發(fā)育、應激反應以及信號通路調(diào)節(jié)等一系列生理生化過程［6］。研究發(fā)現(xiàn)，TPL/TPR 轉錄輔抑制因子蛋白家族在茉莉酸信號轉導通路、植物生長激素信號通路和獨角金內(nèi)酯信號通路中起非常重要的作用［7］。MYB44 轉錄因子在R2R3-MYB 型轉錄因子中研究最為深入，并含有EAR 基序。研究已明確MYB44 轉錄因子通過EAR 基序與TPL/TPRs 蛋白直接互作，從而抑制特定基因的轉錄活性，進一步調(diào)控植物的發(fā)育、脅迫反應和激素信號等［8］。研究發(fā)現(xiàn)，MYB44 與TPRs 形成復合物，并招募組蛋白去乙酰化酶以信號非依賴性方式抑制蛋白磷酸酶2C（PP2Cs）基因的轉錄，增強植株對干旱和鹽脅迫的耐受性［8-9］。此外，MYB44 參與調(diào)控多種植物抗逆信號通路，包括脫落酸介導的對非生物脅迫的耐受性、通過調(diào)控乙烯信號通路參與抵抗害蟲的作用以及通過水楊酸信號通路增強擬南芥對丁香假單胞菌番茄致病變種（PstDC3000）的抗性［10-11］。Causier 等人通過酵母雙雜交和雙分子熒光互補試驗，證實了EAR 基序在MYB44 與TPRs蛋白互作中具有重要作用，EAR 基序突變能阻斷AtMYB44 與TPRs 蛋白之間的互作［12-13］。目前，玉米中R2R3-MYB型轉錄因子的相關研究尚未見報道。

本實驗室前期通過對玉米R2R3-MYB 基因家族進行分析，發(fā)現(xiàn)ZmMYB153 與MYB44 序列一致性最高，為63.54%（NCBI-blastp），且同樣含有EAR 基序。但是，ZmMYB153 與TPL/TPRs 的互作關系以及EAR 基序在其互作中的功能尚未明確。本研究擬利用酵母雙雜交技術對ZmMYB153與TPL/TPRs 的互作關系進行分析驗證，為闡明ZmMYB153 在玉米生長、發(fā)育和抵抗生物、非生物脅迫中的功能和調(diào)控機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

酵母雙雜交載體PGBKT7（BD）和PGADT7（AD）、酵母菌株AH109、玉米自交系B73 和擬南芥野生型Col-0，由河北省植物生理與分子病理學重點實驗室/河北農(nóng)業(yè)大學真菌毒素與植物分子病理學實驗室保存和提供。

1.2 ZmMYB153、ZmMYB153-mEAR 的酵母雙雜交載體的構建

利用SDS 法，提取玉米自交系B73 的總RNA；利用TaKaRa cDNA 合成試劑盒，進行其cDNA 的合成。使用ZmMYB153 和ZmMYB153-mEAR 的特異性上下游引物（表1），以玉米自交系B73 的cDNA 為模板，擴增ZmMYB153 和ZmMYB153-mEAR。將ZmMYB153 和ZmMYB153-mEAR 分別與入門載體pBM27 連接，轉化Trans 5α，抗性篩選獲得的陽性克隆進行菌落PCR 和測序鑒定后，與終載體BD、AD 進行LR 重組反應，經(jīng)PCR 和測序鑒定后獲得BD-ZmMYB153、AD-ZmMYB153、BD-ZmMYB153-mEAR、AD-ZmMYB153-mEAR。

1.3 TPL/TPRs 的酵母雙雜交載體的構建

利用OMEGA 植物RNA 提取試劑盒，提取擬南芥Col-0 的總RNA；利用TaKaRa cDNA 合成試劑盒，進行其cDNA 的合成。使用TPL/TPRs 特異性上下游引物（表1），擴增TPL/TPRs 基因序列，并將其分別與入門載體pBM27 連接，進行克隆、測序后獲TPL/TPRs 的入門載體TPL-pBM27、TPR1-pBM27、TPR2-pBM27、TPR3-pBM27 和TPR4-pBM27。利用LR 重組試劑盒，將TPL/TPRs 的入門載體分別與終載體BD、AD 進行重組反應，經(jīng)PCR 和測序鑒定后獲得TPL/TPRs 的酵母雙雜交載體。

表1 試驗所用引物Table 1 Primers used in this study

1.4 ZmMYB153、TPL/TPR 的自激活活性檢測

將5 μL 預冷的BD-ZmMYB153、BD-TPL、BD-TPR1、BD-TPR2、BD-TPR3、BD-TPR4 和空載體BD 分別轉化酵母感受態(tài)AH-109，涂布于-Trp 培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)48 ～96 h。挑取BDZmMYB153、BD-TPL、BD-TPR1、BD-TPR2、BD-TPR3、BD-TPR4 和BD 的酵母菌落， 接種于5 mL 的-Trp 液體培養(yǎng)基中，30 ℃ 200 r/min 震蕩培養(yǎng)24 h，定量點于-Trp 和-Trp/-His 培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)2 ～3 d。依據(jù)菌落生長情況，判定ZmMYB153、TPL/TPRs 的自激活活性。

1.5 ZmMYB153 與TPL/TPRs 的酵母雙雜交

將4 μL AD-ZmMYB153 質(zhì)粒分別與4 μL 的BD-TPL、BD-TPR1、BD-TPR2、BD-TPR3 和BDTPR4 質(zhì)粒組合，以及4 μL BD-ZmMYB153 質(zhì)粒分別與4 μL AD-TPL、AD-TPR1、AD-TPR2、ADTPR3 和AD-TPR4 質(zhì)粒組合，同時設對照組合ADZmMYB153+BD、AD+BD-TPL、AD+BD-TPR1、AD+BD-TPR2、AD+BD-TPR3、AD+BD-TPR4、BD-ZmMYB153+AD、BD+AD-TPL、BD+ADTPR1、BD+AD-TPR2、BD+AD-TPR3、BD+ADTPR4 和BD+AD，將各個組合分別轉入酵母細胞。將酵母細胞涂布在-Leu/-Trp 固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)2 ～3 d 直至長出酵母克隆。挑取雙缺培養(yǎng)基上生長較好的酵母單克隆震蕩培養(yǎng)至OD600為0.2，然后將原菌液稀釋10 倍和100 倍，各吸取5 μL 置于-Leu/-Trp、-Leu/-Trp/-His 和-Leu/-Trp/-His+3-AT培養(yǎng)基上，30 ℃繼續(xù)培養(yǎng)2 ～3 d 觀察酵母生長情況。

1.6 EAR 突變對ZmMYB153 與TPL/TPRs 互作的影響

利用同樣的方法，將ZmMYB153-mEAR 與上述發(fā)生互作的TPR2 質(zhì)粒組合，轉化酵母感受態(tài)細胞，同時設ZmMYB153 與其互作的TPR2 組合為陽性對照設置以及相對應的陰性對照組合，觀察各組合的酵母菌落在-Leu/-Trp、-Leu/-Trp/-His 和-Leu/-Trp/-His+3-AT 培養(yǎng)基上的生長情況。

2 結果與分析

2.1 ZmMYB153 和ZmMYB153-mEAR 酵母雙雜交載體的構建

根據(jù)圖1 的設計， 使用ZmMYB153 及ZmMYB153-mEAR 的特異性上下游引物擴增得到ZmMYB153（1 038 bp）和ZmMYB153-mEAR（1 014 bp） 的基因片段，與入門載體pBM27 連接，獲得其入門載體ZmMYB153-pBM27 和ZmMYB153-mEAR-pBM27，并將其分別與目標載體PGBKT7 和PGADT7 進行重組反應，菌落PCR 鑒定均獲得了目的條帶（圖1）。經(jīng)測序鑒定后獲得目的載體ADZmMYB153、BD-ZmMYB153、AD-ZmMYB153-mEAR 和BD-ZmMYB153-mEAR。

圖1 ZmMYB153 和ZmMYB153-mEAR 酵母雙雜交 載體的構建Fig.1 Vector construction of ZmMYB153 and ZmMYB153-mEAR

2.2 TPL/TPRs 酵母雙雜交載體的構建

利用TPL/TPRs 特異性上下游引物擴增得到TPL （1 032 bp）、TPR1（1 029 bp）、TPR2（1 005 bp）、 TPR3（1 005 bp）和TPR4（1 032 bp）的基因片段， 與入門載體pBM27 連接，獲得這些基因的入門載體 TPL-pBM27、TPR1-pBM27、TPR2-pBM27、TPR3-pBM27 和TPR4-pBM27。將這些基因的入門載體分別與目標載體PGADT7 和PGBKT7 重組，菌落PCR 鑒定均獲得了目的條帶（圖2）。經(jīng)測序鑒定后獲得目的基因的酵母雙雜交載體AD-TPL、BD-TPL、AD-TPR1、BD-TPR1、AD-TPR2、BDTPR2、AD-TPR3、BD-TPR3、AD-TPR4 和BDTPR4。

圖2 TPL/TPRs 酵母雙雜交載體的構建Fig.2 Vector construction of TPL/TPRs

2.3 ZmMYB153 和TPL/TPRs 的自激活活性檢測

對ZmMYB153、TPL/TPRs 的自激活活性檢測，結果發(fā)現(xiàn)，轉化了BD-ZmMYB153、BD-TPL、BDTPR1、BD-TPR2、BD-TPR3、BD-TPR4 和 空 載體BD 的酵母均能夠在-Trp 培養(yǎng)基上生長良好，轉化了BD-TPR2 和BD-TPR4 的酵母均能夠在-Trp/-His 和-Trp/-His+x-α-gal 的培養(yǎng)基上生長良好，且在-Trp/-His+x-α-gal 的培養(yǎng)基上顯藍色，說明BDTPR2 和BD-TPR4 有自激活活性（見圖3）。

圖3 ZmMYB153、TPL/TPRs 的自激活活性檢測Fig.3 Self-activation activity of ZmMYB153 and TPL/TPRs

2.4 ZmMYB153 與TPL/TPRs 的酵母雙雜交互作鑒定

利用酵母雙雜交技術，檢測ZmMYB153 與TPL/TPRs 蛋白之間的互作關系，結果發(fā)現(xiàn)，共同轉化AD-ZmMYB153+BD-TPR2、BD-ZmMYB153+ AD-TPR2 組合的酵母菌落在-Lue/-Trp、-Lue/-Trp/ -His 和-Lue/-Trp/-His+3-AT (10 mmol/L) 培養(yǎng)基上均能正常生長；而共同轉化AD-ZmMYB153+BD -AtTPR4 組合的酵母菌落能夠在-Leu/-Trp、-Leu/ -Trp/-His 培養(yǎng)基上均能正常生長，不能在-Lue/ -Trp/-His+3-AT (10 mmol/L)培養(yǎng)基上正常生長；其他組合的酵母菌落以及陰性對照組合的酵母菌落只能在-LT 培養(yǎng)基上正常生長，而不能在-Lue/-Trp/-His和-Lue/-Trp/-His+3-AT (10 mmol/L) 培養(yǎng)基上正常生長（圖4）。表明ZmMYB153 與AtTPR2 在酵母細胞中能夠直接互作。

圖4 ZmMYB153 與TPL/TPRs 的酵母雙雜交結果Fig.4 Yeast two-hybrid of ZmMYB153 and TPL/TPR

2.5 EAR 突變對ZmMYB153 與TPR2 互作的影響

利用酵母雙雜交技術，檢測EAR 突變對ZmMYB153 與TPR2 互作的影響，結果發(fā)現(xiàn)，與陽性對照相比，試驗組合AD-ZmMYB153-mEAR+BDTPR2、BD-ZmMYB153-mEAR+AD-TPR2 的酵母菌落在-Lue/-Trp/-His+3-AT(10 mmol/L)的培養(yǎng)基上均未能生長（見圖5）。表明ZmMYB153-mEAR 與AtTPR2 不互作，同時說明EAR 基序是ZmMYB153與AtTPR2 蛋白在酵母中互作的關鍵位點。

圖5 EAR 突變對ZmMYB153 與TPR2 互作的影響Fig.5 Effect of EAR motif mutation on interaction between ZmMYB153 and TPR2

3 結論與討論

R2R3-MYB 蛋白在植物中起到非常重要的作用，MYB44 屬于R2R3-MYB 蛋白家族的第22 亞家族，現(xiàn)已明確AtMYB44 通過調(diào)節(jié)細胞分裂素和生長素相關基因的表達參與N-3-氧代-己酰-高絲氨酸內(nèi)酯介導擬南芥的初級根生長［14］；AtMYB44基因在植株干旱、低溫和高鹽等各種非生物脅迫下被活化表達，從而增強植物的抗逆性［9,15］；AtMYB44與ABA 受體PYR1-LIKE8（PYL8）的相互作用還介導葉片衰老過程并對外界的刺激和傷害作出反 應［16］。此外，在甘藍型油菜中發(fā)現(xiàn)BnMYB44 可能有助于甘藍型油菜抵抗干旱和鹽脅迫，StMYB44通過抑制馬鈴薯中PHOSPHATE1 的表達來負調(diào)節(jié)磷酸鹽轉運，促進植物吸收無機磷酸鹽（Pi）以滿足植物各種結構和生理功能對磷的需求［17-18］。

在擬南芥中，AtMYB44 與TPL/TPRs 蛋白家族中的TPR1 和TPR3 有相互作用的關系，參與調(diào)控擬南芥種子發(fā)育、抵抗PstDC3000、灰葡萄孢和蚜蟲等生物脅迫過程以及對干旱、低溫和高鹽等非生物脅迫的多種過程，其主要機制是LSLSL 型乙烯反應元件結合因子相關的兩親抑制基序（EAR）介導的基因轉錄［19］。在擬南芥中證明了EAR 阻遏物通過招募染色質(zhì)重塑因子的模型（通過募集染色質(zhì)修飾劑實現(xiàn)EAR 介導的抑制模型），促進基因表達的表觀遺傳調(diào)控。生物信息學分析發(fā)現(xiàn)AtMYB44 與ZmMYB153 同源，但其與TPL/TPRs 之間的互作關系及其在玉米中的調(diào)控機制尚未明確。本研究結果為闡明ZmMYB153 在玉米生長、發(fā)育和抵抗生物、非生物脅迫中的功能和調(diào)控機制奠定基礎。

植物轉錄輔抑制因子TPL/TPRs 家族蛋白調(diào)節(jié)多種過程中的基因表達，在水稻中LxLxL 類型EAR基序以疏水鍵為主要作用結合OsTPR2 的TPD 單體的CTLH 口袋［20-23］。TPL/TPRs 家族蛋白N 末端含有LisH 和CTLH 結構域，而LisH 和CTLH 結構域已被證明能促進蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，它可能在結合伴侶蛋白中起共同作用［24］。乙酰基轉移酶PopP2 通過假定的EAR 基序，可與對茄形青枯菌（Pseudomonas solanacearum）具有抗性的免疫受體RRS1 DNA 結合域結合并對其進行乙?；瑢е翿RS1-DNA 結合減少，從而激活植物的免疫 力［25］。此外，EAR 阻遏物的功能可能與磷酸化和泛素化有關［20］。本研究初步確定了ZmMYB153 與TPL/TPRs 之間的相互作用，推測ZmMYB153 通過自身的LSLSL 型EAR 基序招募TPL/TPRs 家族中一些蛋白的LisH 或CTLH 結構域，形成復合體，從而抑制相關基因的表達，進一步參與玉米生長發(fā)育以及響應生物和非生物脅迫過程。本試驗將對ZmMYB153 調(diào)控的靶基因及其調(diào)控機制進行深入研究，為闡明ZmMYB153 在玉米生長、發(fā)育和抵抗生物、非生物脅迫中的功能和調(diào)控機制奠定基礎。