夏成凱，方成武

(1.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院 亳州中醫(yī)藥研究所，安徽 亳州 236800；2.亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽 亳州 236800；3.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230031)

牡丹皮為毛茛科植物牡丹PaeoniasuffruticaosaAndr.的干燥根皮，具有清熱涼血，活血化瘀之功效，用于溫毒發(fā)斑，吐血鈕血，夜熱早涼，癰腫瘡毒，跌撲傷痛[1]。牡丹皮是常用傳統(tǒng)中藥材，在臨床使用中，主要使用其生品、酒炙品和炒(炭)制品，起到減毒增效的作用。

近年來(lái)中藥材中的重金屬問(wèn)題引發(fā)關(guān)注，中藥材重金屬超標(biāo)引發(fā)的安全問(wèn)題也是中藥材產(chǎn)業(yè)發(fā)展面臨的重要問(wèn)題。中藥湯劑是臨床應(yīng)用較為廣泛的劑型，通?；颊呤褂闷滹嬈逡?，服用前棄去其沉淀，因此只有藥材飲片中的重金屬轉(zhuǎn)移到煎液中才會(huì)被人體吸收，對(duì)人體造成影響。因此，研究水煎液中重金屬轉(zhuǎn)移率就顯得尤為重要。中藥材不同的炮制方法及炮制程度會(huì)對(duì)其主要成分及微量元素產(chǎn)生影響，因此炮制方法及過(guò)程是否會(huì)對(duì)飲片中重金屬轉(zhuǎn)移率有所影響，炮制前后的重金屬轉(zhuǎn)移率是否發(fā)生變化，與炮制后達(dá)到的減毒增效是否具有相關(guān)性都值得探討。

電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)檢測(cè)微量元素具有簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于中藥微量元素分析中[2-4]，劉威等[5]采用ICP-MS對(duì)牡丹皮中24種微量元素的特性做過(guò)研究，牡丹皮中重金屬金屬元素鐵、鋅、銅、錳及有害元素的檢測(cè)也有相關(guān)研究[6-7]，甘彥雄等[8]發(fā)現(xiàn)莪術(shù)醋制前后重金屬轉(zhuǎn)移率有所變化。本實(shí)驗(yàn)采用ICP-MS法測(cè)定牡丹皮生品、酒炙品與炒(炭)制品，煎液，沉淀物中重金屬含量并分析其轉(zhuǎn)移變化情況。

1 材料與方法

1.1 供試材料

萊伯泰科Milestone ETHOS UP微波消解儀(意大利邁爾斯通)；NexlON 350X 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(美國(guó)PerkinElmer公司)；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司)；高速粉碎機(jī)(浙江省永康市溪岸五金藥具廠(chǎng))。

高純度硝酸(美國(guó)貝克公司)；調(diào)諧液(美國(guó)PerkinElmer公司)。鈧(Sc)、鍺(Ge)、銦(In)、錳(Mn)、銅(Cu)、鋅(Zn)、砷(As)、鎘(Cd)、鉛(Pb)、汞(Hg)標(biāo)準(zhǔn)溶液(國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心，濃度為1 000 μg/mL)。胡蘿卜標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(地球物理地球化學(xué)勘查研究所，編號(hào)為GBW10047)。

牡丹皮飲片，分別購(gòu)于安徽協(xié)和成藥業(yè)有限公司(批號(hào)15092409)，安徽普仁中藥飲片有限公司(批號(hào)16070911)，亳州永剛飲片廠(chǎng)有限公司(批號(hào)18031419)，銅陵禾田藥業(yè)有限公司(批號(hào)18011312)，亳州滬譙藥業(yè)有限公司(批號(hào)16122720)，安徽康博藥業(yè)有限公司(批號(hào)17122315)。經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)方成武教授鑒定為PaeoniasuffruticaosaAndr.的干燥根皮生品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的制備 酒牡丹皮：取牡丹皮飲片，每500 g牡丹皮加60 g黃酒拌勻后悶透，放鍋內(nèi)用文火炒干，取出放涼。

牡丹皮炭：取500 g牡丹皮，用中火加熱炒至表面黑褐色，內(nèi)部黃褐色，噴淋少許清水，取出放涼，篩去碎屑。

飲片樣品的制備：分別取適量的牡丹皮生品，酒炙品，炭制品飲片于打粉機(jī)中粉碎后，過(guò)80目篩，既得，樣品用密封袋密封保存，并置于干燥處備用。

煎液及沉淀樣品樣品的制備：分別精密稱(chēng)取牡丹皮生品約80 g，牡丹皮酒炙品約80 g、牡丹皮炭制品約60 g，生品及炮制品分別加8倍量超純水，浸泡30 min煎煮3次，每次30 min，合并所得濾液，使之混勻，靜置15 min后倒出上清液，剩下沉淀液約有50 mL，用電熱鍋加熱使其濃縮成恒重干膏并精密稱(chēng)定重量，即得煎液及沉淀樣品(表1)，用陶瓷研缽研成細(xì)微粉末無(wú)大顆粒即得。

表1 飲片及其煎液干膏、沉淀干膏的重量

1.2.2 樣品的消解 分別精密稱(chēng)取牡丹皮不同炮制品樣品粉末0.1 g，置于消解罐中，加5 mL硝酸至反應(yīng)停止，加入2 mL雙氧水，不斷輕搖消解罐，使樣品充分混勻，放置過(guò)夜，按照以0.5 MPa、1 000 W、100 s，10 MPa、1 000 W、100 s，15 MPa、1 000 W、150 s的程序進(jìn)行樣品消解，待消解程序結(jié)束，降至室溫將所得的消解液轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中，用超純水潤(rùn)洗消解罐數(shù)次，將潤(rùn)洗液合并至50 mL容量瓶，定容，搖勻，即得供試品溶液。按照樣品消解的方法制備胡蘿卜標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)供試品和空白對(duì)照溶液。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液及內(nèi)標(biāo)溶液的制備

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備 精密吸取各標(biāo)準(zhǔn)品原液(濃度為1 000 μg/mL)50 μL，分別置于50 mL的容量瓶中，用10%的硝酸定容，制備成1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液[9]。

1.2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 精密吸取一定量的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，放置于50 mL的容量瓶中，并用10%硝酸定容，配制成一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品待測(cè)液。標(biāo)準(zhǔn)溶液：汞：0.01、0.05、0.1、0.5、1 μg/L；混標(biāo)(砷、鎘)：0.1、0.5、1、10、50、100 μg/L；混標(biāo)(銅、鉛、錳、鋅)：0.5、1、10、50、100、500 μg/L。

1.2.3.3 內(nèi)標(biāo)溶液的制備 精密量取In、Ge、Sc單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，制備成1 μg/mL的混合溶液。

1.2.4 ICP-MS 測(cè)定工作條件 工作參數(shù)：射頻功率1 100 W；冷卻氣流速15 L/min；輔助氣流量1.2 L/min；載氣流量0.9 L/min；駐留時(shí)間20 s；數(shù)據(jù)采集方式：跳峰；KED模式；氦氣流速1.2 L/min。

1.2.5 方法學(xué)考察

1.2.5.1 線(xiàn)性關(guān)系 將制備的各標(biāo)準(zhǔn)品待測(cè)液依次經(jīng)過(guò)ICP-MS測(cè)定，5種元素的線(xiàn)性關(guān)系r值均在0.999 5～0.999 7范圍之內(nèi)，表明其線(xiàn)性關(guān)系良好。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

表2 線(xiàn)性關(guān)系考察(n=6)

1.2.5.2 準(zhǔn)確度及精密度實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱(chēng)取胡蘿卜標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.1 g，同法制備供試品溶液，按照上述方法進(jìn)行測(cè)定。計(jì)算5種無(wú)機(jī)元素含量(mg/kg)，比較測(cè)定值與標(biāo)準(zhǔn)值，結(jié)果表明5種元素的含量均在標(biāo)準(zhǔn)值的范圍內(nèi)，表明試驗(yàn)方法有較好的準(zhǔn)確性。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。

精密稱(chēng)取胡蘿卜標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.1 g，制備供試品溶液，按照上述方法進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算5種重金屬元素的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD<1.6%，表明試驗(yàn)方法的精密度良好。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。

表3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)驗(yàn)證(n=6)

1.2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取同一批胡蘿卜標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)6份，每份0.1 g，制備供試品溶液，以ICP-MS工作參數(shù)連續(xù)測(cè)定。計(jì)算5種重金屬元素含量的RSD值，結(jié)果顯示均在1.1%～1.6%范圍內(nèi)，表明試驗(yàn)方法的重復(fù)性良好。

2 結(jié)果與分析

2.1 重金屬含量測(cè)定結(jié)果

2.1.1 測(cè)定數(shù)據(jù) 按上述操作方法，測(cè)定各批次牡丹皮生品、酒炙品、炭制品的飲片、煎液和沉淀物中5種重金屬的含量，每份樣品平行測(cè)定3次，所得數(shù)據(jù)見(jiàn)表4。

表4 樣品中重金屬元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)

2.1.2 樣品轉(zhuǎn)移率 計(jì)算牡丹皮不同炮制品飲片及其所得的煎液、沉淀物中重金屬轉(zhuǎn)移率。

表5 樣品中重金屬元素的轉(zhuǎn)移率

2.2 結(jié)果分析

研究結(jié)果表明牡丹皮不同炮制品飲片中5種重金屬含量差距較大，酒牡丹皮、牡丹皮炭中的重金屬含量全部小于牡丹皮生品飲片中含量，而且各批次飲片均未超過(guò)《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(WM2-2001)》中對(duì)于中藥材中重金屬含量的限定值[10]，各重金屬元素的限量標(biāo)準(zhǔn)為Pb≤5.0 mg/kg、Cd≤0.3 mg/kg、Cu≤20.0 mg/kg、As≤2.0 mg/kg、Hg≤0.2 mg/kg。

本次實(shí)驗(yàn)中樣品來(lái)源差異大，部分所測(cè)數(shù)據(jù)差距較大，其中本批牡丹皮樣品中重金屬Cu的含量最高，Pb次之，Hg的含量最低。從檢測(cè)所得數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，沉淀物中的重金屬含量多于煎液中重金屬含量，但沉淀物的重金屬轉(zhuǎn)移率低于煎液中重金屬轉(zhuǎn)移率。雖然重金屬Cu的含量最高，但它的總轉(zhuǎn)移率最低，多為3.0%±1.0%，對(duì)此可推測(cè)Cu在牡丹皮中多以難溶于水的形態(tài)存在，而且炮制后的轉(zhuǎn)移率相差不大；從整體來(lái)看，重金屬As的轉(zhuǎn)移率最高，生品的總轉(zhuǎn)移率為(35%±25%，酒炙品多為(35%±15%，炭制品為(10%±6%，酒炙后顯著升高，炭制后顯著下降，可能與As為非金屬元素，炭化溫度較高有關(guān)?？傮w來(lái)看Cd的含量降低了，總轉(zhuǎn)移率變化不大。Hg總轉(zhuǎn)移率生品與酒炙品的差距不大，可以推測(cè)酒炙對(duì)牡丹皮中重金屬Hg含量的改變影響不大。炭制后的牡丹皮5種重金屬的總轉(zhuǎn)移率略有降低但仍低酒炙飲片的轉(zhuǎn)移率；酒炙煎液中As重金屬總轉(zhuǎn)移率均偏高，可推測(cè)酒炙后可促進(jìn)牡丹皮中重金屬的轉(zhuǎn)移。

3 結(jié)論與討論

3.1 重金屬危害的分析

中藥材中重金屬殘留是影響中藥材產(chǎn)業(yè)發(fā)展的因素，雖然重金屬Cu的含量最高，但它的總轉(zhuǎn)移率最低，由此可推測(cè)Cu在牡丹皮中多以難溶于水的形態(tài)存在，煎煮使用后對(duì)患者的影響不大。當(dāng)前中藥材及飲片中重金屬采用一定的限量標(biāo)準(zhǔn)具有較好的意義，中藥材使用應(yīng)兼顧炮制方法等，制定較為合理的不同中藥炮制品的重金屬限量標(biāo)準(zhǔn)，科學(xué)對(duì)待中藥材的重金屬。

3.2 消除實(shí)驗(yàn)中的干擾因素

每次樣品消解完成后，消解罐會(huì)殘留部分樣品殘留對(duì)進(jìn)行下一次樣品消解產(chǎn)生影響，所以每次消解完一批次樣品后可以對(duì)消解罐進(jìn)行清洗。先用超純水潤(rùn)洗，再加入少許硝酸后，進(jìn)行微波消解，待消解程序結(jié)束后冷卻至60 ℃以下打開(kāi)消解罐，再用超純水沖洗數(shù)遍，放置與避光處，晾干，下次即可用。因部分樣品為煎液濃縮成的干膏與沉淀物，單加入硝酸，樣品可能無(wú)法完全消解，存在沉淀物與絮凝物，沒(méi)有完全消解成功，所以在進(jìn)行消解時(shí)，可以加2 mL過(guò)氧化氫，使樣品消解完全。

3.3 影響重金屬含量的因素

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，部分批次牡丹皮中重金屬含量與轉(zhuǎn)移率差異較大，與牡丹皮的產(chǎn)地因素有關(guān)，之前有學(xué)者研究過(guò)安徽三個(gè)產(chǎn)區(qū)的牡丹皮中的農(nóng)殘與重金屬含量的差異[11]以及比較不同產(chǎn)地牡丹皮中無(wú)機(jī)元素的含量[12]，推測(cè)藥材中重金屬的含量與產(chǎn)地栽培環(huán)境是相關(guān)的。有研究川附子的炮制過(guò)程進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)炮制前后藥材重金屬的濃度發(fā)生了變化[13]，牡丹皮飲片經(jīng)過(guò)炮制后多數(shù)重金屬的轉(zhuǎn)移率是有所降低的，而轉(zhuǎn)移到沉淀物中的重金屬含量大于煎液中的含量，而一般這些沉淀物在患者飲用前棄去，所以煎液中存在的重金屬含量只占小部分，而這些微量的重金屬元素對(duì)人體影響不大，所以建議患者在飲藥前濾去藥渣，靜置數(shù)分鐘后舍去底部的沉淀物與肉眼可見(jiàn)的絮凝物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為中藥炮制技術(shù)的科學(xué)性提供了依據(jù)，也有利于今后進(jìn)一步制定與研究中藥炮制標(biāo)準(zhǔn)。重金屬對(duì)人體產(chǎn)生影響，往往是多種重金屬共同的作用[14]，因此對(duì)于重金屬在藥材中的存在形態(tài)和控制藥材的重金屬污染[15]，以及人體對(duì)于進(jìn)入體內(nèi)重屬元素的吸收與積累狀況也是值得大家去探究的。