林祥日，謝丹丹，林旭吟，趙梅英

(廈門(mén)海洋職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物技術(shù)系，福建 廈門(mén) 361100)

上世紀(jì)80年代以來(lái),世界范圍內(nèi)廣泛出現(xiàn)魚(yú)類(lèi)鏈球菌感染。魚(yú)類(lèi)鏈球菌病已成為世界水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的主要疾病,受感染的魚(yú)類(lèi)包括多種海水、半咸水和淡水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)[1],以羅非魚(yú)最為易感。星洲紅魚(yú)(Red Tilapia) 隸屬于鱸形目(Perciformes)、麗魚(yú)科(Cichlidae)、羅非魚(yú)屬(Tilapia)種間雜交的一個(gè)品種,由新加坡、臺(tái)灣等地的養(yǎng)殖專(zhuān)家經(jīng)過(guò)二十余年的不斷改良而成。其體色全紅,生長(zhǎng)速度快;耐低溫能力強(qiáng);肉質(zhì)鮮滑爽甜,無(wú)肌間刺,與一般羅非魚(yú)相比更受廣大民眾的喜愛(ài)[2]。鏈球菌病對(duì)羅非魚(yú)養(yǎng)殖造成了嚴(yán)重威脅,目前有關(guān)羅非魚(yú)鏈球菌病研究已有不少報(bào)道,國(guó)內(nèi)、外報(bào)道主要病原有海豚鏈球菌(Streptococcusiniae)[3-4]和無(wú)乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)[5-7]2種。有關(guān)星洲紅魚(yú)的研究主要集中在健康養(yǎng)殖技術(shù)[2]、形態(tài)[8-10]、染色體和細(xì)胞核 DNA含量[9]、呼吸代謝[11-12]等方面,而對(duì)星洲紅魚(yú)鏈球菌病研究尚少。本研究采用無(wú)乳鏈球菌對(duì)30～50 g大小的健康的星洲紅魚(yú)進(jìn)行人工感染試驗(yàn)和藥敏試驗(yàn),旨在對(duì)無(wú)乳鏈球菌的致病性以及藥物敏感性進(jìn)行研究,以期為預(yù)防無(wú)乳鏈球菌引起的魚(yú)類(lèi)細(xì)菌性疾病提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 試驗(yàn)用魚(yú) 星洲紅魚(yú)來(lái)自廈門(mén)市集美灌口養(yǎng)殖場(chǎng),體重30～50 g/尾。星洲紅魚(yú)經(jīng)5 d暫養(yǎng)適應(yīng),穩(wěn)定后供人工感染用。

1.1.2 試驗(yàn)材料 腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基(BHI)，營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA)購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；藥敏紙片購(gòu)自杭州微生物制劑有限公司；麥?zhǔn)媳葷峁苜?gòu)自廣州環(huán)凱微生物有限公司。

1.1.3 菌株 感染試驗(yàn)用的無(wú)乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae,SCTnS110902NA菌株)是由福建省淡水水產(chǎn)研究所提供的。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人工感染試驗(yàn) 將無(wú)乳鏈球菌菌株接種于腦心浸液(BHI)瓊脂培養(yǎng)基中,30 ℃培養(yǎng)48 h,用無(wú)菌生理鹽水配制成2.0×109、2.0×108、2.0×107、2.0×106、2.0×105CFU/mL的細(xì)菌懸液(采用平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)),每個(gè)梯度設(shè)置2組, 每組6尾,每尾肌肉注射細(xì)菌懸液0.2 mL,對(duì)照組注射相同劑量的無(wú)菌生理鹽水。將試驗(yàn)魚(yú)和對(duì)照魚(yú)飼養(yǎng)在水溫為28 ℃的不同水族箱(100 cm×50 cm×35 cm)中,連續(xù)充氣,每天觀察供試魚(yú)的發(fā)病癥狀與死亡情況,并及時(shí)撈出死魚(yú),連續(xù)觀察15 d。

1.2.2 人工感染后星洲紅魚(yú)體內(nèi)菌落總數(shù)測(cè)定 選用2.0×108CFU/mL菌液濃度進(jìn)行人工感染試驗(yàn)。設(shè)置試驗(yàn)組與對(duì)照組,其中試驗(yàn)組設(shè) 2組,每組20尾魚(yú)。將無(wú)乳鏈球菌菌株接種于腦心浸液(BHI)瓊脂培養(yǎng)基中,30 ℃培養(yǎng)48 h,用無(wú)菌生理鹽水配制成2.0×108CFU/mL的細(xì)菌懸液,給2組試驗(yàn)魚(yú)注射,每尾肌肉注射細(xì)菌懸液0.2 mL,對(duì)照組注射相同劑量的無(wú)菌生理鹽水,將試驗(yàn)魚(yú)和對(duì)照魚(yú)飼養(yǎng)在水溫為25 ℃的水族箱(30 cm×25 cm×50 cm)中。試驗(yàn)魚(yú)一組用于統(tǒng)計(jì)感染無(wú)乳鏈球菌后星洲紅魚(yú)的癥狀和死亡情況,另一組用于統(tǒng)計(jì)體內(nèi)細(xì)菌菌落數(shù)的動(dòng)態(tài)變化,分別在感染后0、24、48、96、192 h隨機(jī)取3尾。對(duì)照組在感染后0和192 h隨機(jī)取3尾。用75%酒精擦拭魚(yú)體表消毒,無(wú)菌解剖,檢測(cè)星洲紅魚(yú)肌肉、肝臟、心臟等組織細(xì)菌動(dòng)態(tài)分布。菌落總數(shù)測(cè)定方法參照GB4789.2-2016食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定。

1.2.3 藥物敏感試驗(yàn) 采用藥敏紙片瓊脂平板擴(kuò)散法[5,13-14]。將無(wú)乳鏈球菌菌株接種于腦心浸液(BHI)瓊脂培養(yǎng)基,經(jīng)30 ℃培養(yǎng)48 h,用無(wú)菌生理鹽水配制成濃度1.0×108CFU/mL細(xì)菌懸液(相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)),用無(wú)菌微量移液槍移取100 μL細(xì)菌懸液于BHI平板上,用無(wú)菌玻璃涂棒在培養(yǎng)基表面上輕輕地涂布均勻,室溫下靜置5～10 min,適當(dāng)干燥,使菌液吸附在培養(yǎng)基上,然后貼上藥敏紙片。每皿4片,每種藥物2片,倒置放入30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后,測(cè)量藥敏紙片周?chē)志h(huán)直徑的大小。根據(jù)杭州微生物制劑有限公司的藥敏紙片法的抑菌范圍解釋標(biāo)準(zhǔn)判定菌株對(duì)藥物的敏感度。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 所有的數(shù)據(jù)均用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)形式表示。采用 SPSS軟件進(jìn)行方差分析和多重比較及回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工感染試驗(yàn)

試驗(yàn)結(jié)果表明:所選用的無(wú)乳鏈球菌菌株對(duì)星洲紅魚(yú)具有較強(qiáng)的致病力。通過(guò)人工感染,注射5個(gè)不同濃度菌液的試驗(yàn)魚(yú)相繼出現(xiàn)不同程度的死亡(表1)。注射較高濃度菌液的魚(yú)死亡數(shù)量較多,注射較低濃度菌液的魚(yú)死亡數(shù)量較少,其中菌液濃度達(dá)2.0×109CFU/mL時(shí),死亡率最高(91.7%)。魚(yú)死前多數(shù)出現(xiàn)不安、狂游的狀況。部分魚(yú)體出現(xiàn)腹部出血、蛀鰭,眼球渾濁、突出等鏈球菌病典型癥狀,與自然發(fā)病魚(yú)的癥狀相似。對(duì)照組在觀察的時(shí)間里,表現(xiàn)正常,無(wú)死亡現(xiàn)象。

表1 人工感染試驗(yàn)結(jié)果

2.2 人工感染后星洲紅魚(yú)體內(nèi)細(xì)菌菌落數(shù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)結(jié)果表明:對(duì)照組星洲紅魚(yú)在試驗(yàn)時(shí)間內(nèi)(192 h)表現(xiàn)正常,無(wú)死亡現(xiàn)象。試驗(yàn)組星洲紅魚(yú)肌肉注射無(wú)乳鏈球菌懸液后,在試驗(yàn)時(shí)間內(nèi)均未死亡,但部分魚(yú)出現(xiàn)明顯的發(fā)病癥狀,主要表現(xiàn):離群獨(dú)游,體表局部出血,鰭基部充血、發(fā)紅,尾柄潰爛;眼球突出或渾濁發(fā)白,眼眶充血;肝臟和腎臟腫大、出血等癥狀。

由表2可知,星洲紅魚(yú)肌肉、肝臟的菌落數(shù)均隨感染時(shí)間的延長(zhǎng)有上升的趨勢(shì),高峰值均為感染后192 h。心臟的菌落數(shù)隨感染時(shí)間變化不呈一定的規(guī)律性，但高峰值也是感染后192 h。由表3可知,對(duì)照組星洲紅魚(yú)在試驗(yàn)時(shí)間內(nèi)(192 h)各組織的細(xì)菌菌落數(shù)少且變化不明顯,t檢驗(yàn)結(jié)果表明感染時(shí)間對(duì)對(duì)照組星洲紅魚(yú)肝臟、肌肉、心臟的菌落數(shù)無(wú)顯著影響(P>0.05)。方差分析表明,不同感染時(shí)間試驗(yàn)組星洲紅魚(yú)肝臟、肌肉、心臟的菌落數(shù)存在極顯著差異(P<0.01)(表4)。

表2 不同感染時(shí)間試驗(yàn)組星洲紅魚(yú)各組織的菌落數(shù)

表3 不同感染時(shí)間對(duì)照組星洲紅魚(yú)各組織的菌落數(shù)

表4 不同感染時(shí)間星洲紅魚(yú)肝臟、肌肉和心臟菌落數(shù)方差分析表

回歸分析表明,星洲紅魚(yú)肌肉、肝臟的菌落數(shù)與感染時(shí)間之間均存在顯著的曲線相關(guān)關(guān)系(P<0.05),可用二次曲線方程y=b0+b1x+b2x2表示,詳見(jiàn)表5和圖1～2。星洲紅魚(yú)心臟的菌落數(shù)與感染時(shí)間之間相關(guān)關(guān)系不顯著(P>0.05)。

表5 星洲紅魚(yú)各組織菌落數(shù)與感染時(shí)間的回歸方程的系數(shù)

圖1 星洲紅魚(yú)肝臟菌落數(shù)與感染時(shí)間的關(guān)系

圖2 星洲紅魚(yú)肌肉菌落數(shù)與感染時(shí)間的關(guān)系

2.3 藥物敏感試驗(yàn)

試驗(yàn)結(jié)果表明,所選用的無(wú)乳鏈球菌菌株對(duì)青霉素G、萬(wàn)古霉素、紅霉素、阿奇霉素、克拉霉素、四環(huán)素、氧氟沙星、氟哌酸、左氧氟沙星、利福平、強(qiáng)力霉素、妥布霉素、阿米卡星、乙基西梭霉素等14種藥物敏感(S);該菌株對(duì)多粘菌素B、新生霉素、阿莫西林較敏感(I);該菌株對(duì)氨芐西林、頭孢噻肟、丙氟哌酸、慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素、麥迪霉素、氟苯尼考、林可霉素、克林霉素、頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢唑啉、頭孢哌酮、頭孢呋辛、頭孢他啶、呋喃妥因、復(fù)方新諾明、磺胺甲基異惡唑等19種藥物不敏感(R)(表6)。

表6 藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

無(wú)乳鏈球菌病全年都可發(fā)生,水溫25～37 ℃時(shí)較為流行[6,15],32 ℃以上時(shí)尤為多發(fā)[3,16],水溫降至20 ℃以下時(shí)則較少?？砂l(fā)生于各種規(guī)格的羅非魚(yú),但對(duì)較大的魚(yú)(大于100 g)更易感染[7]。發(fā)病進(jìn)程和臨床癥狀受菌液感染濃度和水溫影響明顯。無(wú)乳鏈球菌感染濃度較高時(shí),魚(yú)出現(xiàn)急性死亡,不表現(xiàn)明顯癥狀;采用低濃度無(wú)乳鏈球菌感染時(shí),5 d后魚(yú)表現(xiàn)出眼球渾濁等亞急性感染癥狀[7]。尼羅羅非魚(yú)感染無(wú)乳鏈球菌后,水溫越高,其感染死亡率越高,高溫組(33 ℃)患病羅非魚(yú)出現(xiàn)打轉(zhuǎn)、側(cè)翻、離群狂游、體色發(fā)黑等臨床癥狀。低溫組(25 ℃)發(fā)病羅非魚(yú)僅出現(xiàn)體色發(fā)黑、游動(dòng)緩慢的癥狀[17]。本研究采用無(wú)乳鏈球菌對(duì)30～50 g健康的星洲紅魚(yú)進(jìn)行人工感染試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在28 ℃水溫條件下注射高濃度菌液(2.0×109CFU/mL)的星洲紅魚(yú)死亡數(shù)量較多,死前多數(shù)出現(xiàn)不安、狂游現(xiàn)象;注射較低濃度菌液的星洲紅魚(yú)則死亡數(shù)量較少,表現(xiàn)出亞急性感染癥狀。在25 ℃水溫條件下注射2.0×108CFU/mL菌液的星洲紅魚(yú)在感染192 h內(nèi)沒(méi)有出現(xiàn)死亡,但出現(xiàn)眼球突出或渾濁發(fā)白等亞急性感染癥狀。這與一些學(xué)者的研究結(jié)果是相似[7,17],第二次人工感染試驗(yàn)星洲紅魚(yú)沒(méi)有出現(xiàn)死亡,可能與我們當(dāng)時(shí)的水溫較低和試驗(yàn)魚(yú)規(guī)格較小有關(guān)。

郭富強(qiáng)等對(duì)尼羅羅非魚(yú)研究表明低溫條件下(25 ℃)腦、肝臟、脾臟和腎臟等組織中無(wú)乳鏈球菌的濃度在感染后24 h或48 h即達(dá)到峰值,且組織中無(wú)乳鏈球菌的最大載菌量均較低[17]。朱佳杰等研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)腹腔注射法可使吉富羅非魚(yú)快速感染無(wú)乳鏈球菌而呈現(xiàn)發(fā)病癥狀,并在31～ 32 ℃水溫感染5 h后相繼出現(xiàn)死亡[18]。本研究采用肌肉注射無(wú)乳鏈球菌方式進(jìn)行人工感染,僅對(duì)感染后星洲紅魚(yú)的肝臟、心臟和肌肉組織中的細(xì)菌菌落數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),結(jié)果顯示:25 ℃水溫條件下不同感染時(shí)間試驗(yàn)組星洲紅魚(yú)肝臟、肌肉、心臟的菌落數(shù)存在極顯著差異(P<0.01)。感染后星洲紅魚(yú)肌肉、肝臟的菌落數(shù)均隨感染時(shí)間的延長(zhǎng)有上升的趨勢(shì),心臟的菌落數(shù)隨感染時(shí)間變化不呈一定的規(guī)律性,三者高峰值均為感染后192 h,以肝臟的菌落數(shù)最多。星洲紅魚(yú)肌肉、肝臟的菌落數(shù)與感染時(shí)間之間均存在顯著的曲線相關(guān)關(guān)系(P<0.05),星洲紅魚(yú)心臟的菌落數(shù)與感染時(shí)間之間相關(guān)關(guān)系不顯著(P>0.05)。本研究結(jié)果與一些學(xué)者報(bào)道不一致[17-18],這可能是感染試驗(yàn)用的菌株的毒力、試驗(yàn)魚(yú)品種、機(jī)體免疫力、水溫、注射部位不同所導(dǎo)致[19]。

無(wú)乳鏈球菌易產(chǎn)生耐藥性,不同養(yǎng)殖環(huán)境、反復(fù)或連續(xù)用藥等對(duì)無(wú)乳鏈球菌的耐藥性有直接影響。不同無(wú)乳鏈球菌菌株對(duì)不同藥物的敏感度有較大差異。黃艷華等研究表明無(wú)乳鏈球菌株對(duì)先鋒霉素VI、氧氟沙星、先鋒必、多西環(huán)素和鹽酸沙拉沙星敏感[5]?？聞Φ妊芯勘砻鳠o(wú)乳鏈球菌株對(duì)環(huán)丙沙星、克拉霉素等敏感,對(duì)氨芐西林、克林霉素等耐藥,且各菌株對(duì)萬(wàn)古霉素、慶大霉素、青霉素 G、妥布霉素、頭孢唑啉、阿米卡星的敏感性有所不同[7]。本研究藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明:試驗(yàn)所用的無(wú)乳鏈球菌株菌株對(duì)青霉素G、萬(wàn)古霉素、紅霉素、阿奇霉素、克拉霉素、四環(huán)素、氧氟沙星、氟哌酸、左氧氟沙星、利福平、強(qiáng)力霉素、妥布霉素、阿米卡星、乙基西梭霉素等14種藥物敏感。該菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果與上述學(xué)者研究結(jié)果不盡相同,這可能是與菌株來(lái)源地間的養(yǎng)殖環(huán)境和用藥習(xí)慣不同有關(guān)。

試驗(yàn)所用的無(wú)乳鏈球菌菌株對(duì)星洲紅魚(yú)具有較強(qiáng)的致病力,可選用青霉素G、阿奇霉素、克拉霉素、四環(huán)素、左氧氟沙星、利福平、強(qiáng)力霉素、妥布霉素、阿米卡星和乙基西梭霉素等藥物防治星洲紅魚(yú)無(wú)乳鏈球菌病。