付龍?jiān)?，?彥，王艷芹，趙自超，張英鵬，田 葉，張宗東

(1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，濟(jì)南 250100；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部山東耕地保育科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，濟(jì)南 250100；3.煙臺(tái)市農(nóng)業(yè)綜合執(zhí)法支隊(duì)，山東 煙臺(tái) 264001)

馬鈴薯是世界五大糧食作物之一，單產(chǎn)量高且具有耐貯存、耐貧瘠、抗旱、抗寒等優(yōu)良特性，在世界范圍內(nèi)有著廣泛的種植，是部分國(guó)家人們餐桌上的主食[1]。自明朝中晚期引入我國(guó)以來(lái)，歷經(jīng)400余年發(fā)展，馬鈴薯已成為僅次于水稻、玉米、小麥的第四大糧食作物，播種面積和產(chǎn)量均居世界首位[2-3]。馬鈴薯不但可以作為主糧或蔬菜食用，而且還可是淀粉、乙醇等大宗產(chǎn)品的原料和優(yōu)質(zhì)的動(dòng)物飼料，推動(dòng)馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展對(duì)于保證國(guó)家糧食安全、優(yōu)化種植結(jié)構(gòu)、增加農(nóng)民收入等均具有十分重要的意義。

營(yíng)養(yǎng)性塊莖是馬鈴薯的主要可食用部分，而莖、葉等地上部分的生物量約與塊莖相當(dāng)，富含蛋白質(zhì)、糖類(lèi)等，其合理利用不但具有可觀的經(jīng)濟(jì)效益，而且具有良好的生態(tài)和環(huán)保效益。目前，馬鈴薯莖葉的利用途徑主要有飼料化、材料化和能源化等方式。馬鈴薯莖葉營(yíng)養(yǎng)較為豐富，具有一定飼用價(jià)值，但實(shí)踐中需要解決適口性差、易腐爛和龍葵素的毒性等問(wèn)題：何志軍[4]等將馬鈴薯莖葉與小麥秸稈、玉米秸稈等混合后青貯，提高了馬鈴薯莖葉的青貯品質(zhì)和適口性；楊永在[5]等發(fā)現(xiàn)將馬鈴薯莖葉與全株玉米按一定比例混合后青貯，或添加6%的糖蜜后青貯，均能降低馬鈴薯莖葉中有毒的龍葵素含量，提高青貯品質(zhì)和飼用價(jià)值。馬鈴薯莖葉中含有0.1%～1%的茄尼醇，且相對(duì)于煙草等其它材料價(jià)廉易得，可用于茄尼醇等重要生化原料的提取[6-7]。馬鈴薯莖葉的能源化利用方式則主要是厭氧發(fā)酵生產(chǎn)沼氣，目前的研究報(bào)道主要集中在通過(guò)物料混合或預(yù)處理的手段提高產(chǎn)氣效率方面：Ashekuzzaman S M[8]等比較了馬鈴薯莖等植物原料單獨(dú)發(fā)酵及與牛糞混合發(fā)酵產(chǎn)沼氣效率差異，發(fā)現(xiàn)混合發(fā)酵時(shí)沼氣和甲烷產(chǎn)量顯著增加，并認(rèn)為混合發(fā)酵體系可避免氨積累、揮發(fā)性脂肪酸過(guò)剩等問(wèn)題，同時(shí)營(yíng)養(yǎng)更均衡；周彥峰[9]等利用稀釋100倍的木醋液對(duì)馬鈴薯莖葉進(jìn)行預(yù)處理，促進(jìn)莖葉中纖維成分的降解，提高了產(chǎn)沼氣效率；葛一洪[10]等則以多種不同的離子液體處理馬鈴薯莖葉，可明顯縮短厭氧消化啟動(dòng)停滯期，提高產(chǎn)沼氣量和甲烷體積分?jǐn)?shù)。相較于其它處理方式，厭氧沼氣發(fā)酵對(duì)原材料的純度、衛(wèi)生等要求較低，適用地域更加廣闊，在產(chǎn)出沼氣的同時(shí)產(chǎn)生有肥料利用價(jià)值的沼渣、沼液，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)廢棄物的能源化與肥料化利用，尤其適合在馬鈴薯集中種植區(qū)進(jìn)行推廣。

作為馬鈴薯種植的副產(chǎn)品，莖葉部分在塊莖收獲以后往往會(huì)被暫時(shí)擱置在田間地頭。同其它植物生物質(zhì)材料類(lèi)似，隨時(shí)間推移植株會(huì)逐漸風(fēng)干失水，可溶性碳水化合物(Water Soluble Carbohydrate，WSC)、粗蛋白(Crude Protein，CP)、粗脂肪(Ether Extract，crude fat，EE)等易利用成分快速流失，木質(zhì)纖維化程度不斷加深，不利于發(fā)酵微生物的分解轉(zhuǎn)化，給后續(xù)的資源化利用造成不利影響，導(dǎo)致原料利用率低、產(chǎn)氣效率低下等一系列問(wèn)題的出現(xiàn)[11-13]；但是同時(shí)又有多項(xiàng)研究指出，若以含水率過(guò)高、易降解成分含量豐富的生物質(zhì)材料直接進(jìn)行厭氧沼氣發(fā)酵，則易因原料分解過(guò)快而引起多種有機(jī)酸的超量累積，過(guò)多的有機(jī)酸不能被產(chǎn)甲烷微生物及時(shí)利用，體系pH值急劇降低，出現(xiàn)所謂“過(guò)酸化”現(xiàn)象，阻礙厭氧發(fā)酵的正常進(jìn)行，甚至可能直接導(dǎo)致體系崩潰、產(chǎn)氣失敗[14-15]。因此，了解風(fēng)干過(guò)程對(duì)厭氧沼氣發(fā)酵效率的影響，尋找最佳風(fēng)干程度，對(duì)于提高馬鈴薯莖葉利用率、避免發(fā)酵中的“過(guò)酸化”現(xiàn)象、提高產(chǎn)沼氣效率十分重要。本研究選取新收割的馬鈴薯莖葉并在自然條件下風(fēng)干一定時(shí)間，期間監(jiān)測(cè)WSC，CP，中性洗滌纖維(Neutral Detergent Fiber，NDF，包括半纖維素、纖維素、木質(zhì)素和灰分)等的變化情況；并選取不同風(fēng)干時(shí)間的馬鈴薯莖葉分別進(jìn)行單物料中溫厭氧發(fā)酵，通過(guò)日產(chǎn)氣量、累積產(chǎn)氣量、甲烷含量、pH值等關(guān)鍵指標(biāo)的比較，探索風(fēng)干程度對(duì)產(chǎn)沼氣效率的影響，為馬鈴薯莖葉這種重要生物質(zhì)資源的資源化利用提供一定技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料：

馬鈴薯莖葉取自山東省滕州市馬鈴薯產(chǎn)地，收取時(shí)間為6月份馬鈴薯采收期，分別自然風(fēng)干不同時(shí)間后備用；接種物為取自養(yǎng)豬場(chǎng)厭氧沼氣發(fā)酵設(shè)施的沼渣沼液混合物，4℃冷藏保存?zhèn)溆?，使用?5℃復(fù)蘇2 d；厭氧發(fā)酵物料的總固體(Total Solid，TS)、揮發(fā)性固體(Volatile Solid，VS)、總碳(Total Carbon，TC)、全氮(Total Nitrogen，TN)、碳氮比(C/N)、可溶性碳水化合物(WSC)、粗蛋白(CP)、粗脂肪(EE)、中性洗滌纖維(NDF)含量等理化性質(zhì)見(jiàn)表1。

表1 厭氧發(fā)酵物料的基本特性

1.2 厭氧發(fā)酵裝置

實(shí)驗(yàn)采用批式發(fā)酵。厭氧發(fā)酵裝置為發(fā)酵瓶、連接管和氣體采樣袋組成的發(fā)酵系統(tǒng)，即以2.5 L容積的玻璃瓶(具橡膠塞)作為發(fā)酵瓶，塞子上打孔并以玻璃彎管、橡膠管分別連接鋁箔氣體采樣袋(普萊特，大連)以收集發(fā)酵產(chǎn)生的氣體；物料裝載完畢后，將各發(fā)酵瓶連同氣體采樣袋放于35℃恒溫箱中培養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，每天手工振蕩玻璃瓶2次，以確保物料混合均勻和防止發(fā)酵液分層結(jié)殼。

1.3 實(shí)驗(yàn)方案

1.3.1 馬鈴薯莖葉風(fēng)干實(shí)驗(yàn)

馬鈴薯莖葉收取后，平鋪于野外避雨通風(fēng)處自然風(fēng)干(溫度25℃～35℃)，分別風(fēng)干0 h，12 h，24 h，36 h，48 h，60 h，72 h，84 h，96 h后取回，粉碎至5～10 mm片段后混合均勻，抽真空后置于4℃冰箱存放備用，分別測(cè)定樣品WSC，CP，NDF等含量等指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為3組平行實(shí)驗(yàn)的算數(shù)平均值。

1.3.2 厭氧沼氣發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

共設(shè)置6組實(shí)驗(yàn)處理，分別為新鮮莖葉組、風(fēng)干24 h組、風(fēng)干48 h組、風(fēng)干72 h組、風(fēng)干96 h組和接種物對(duì)照組，分別記為T(mén)1，T2，T3，T4，T5，T0，每組處理均設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。除T0外，各處理組初始TS均設(shè)置為5%(以馬鈴薯莖葉計(jì))，接種物加入量均為500 g，加水補(bǔ)充至2000 mL；T0只含500 g接種物，1500 mL無(wú)菌水，各組物料組成詳見(jiàn)表2所示。物料混合均勻后一次性加入發(fā)酵瓶，以N2向瓶?jī)?nèi)頂部空間吹入2min并迅速蓋緊橡膠塞，以盡量排出空氣制造缺氧環(huán)境。實(shí)驗(yàn)采用35℃中溫發(fā)酵，實(shí)驗(yàn)周期為40 d，實(shí)驗(yàn)期間內(nèi)每天定時(shí)收集氣體采樣袋以測(cè)量產(chǎn)沼氣量及甲烷濃度，每隔3 d在密封狀態(tài)下取發(fā)酵液測(cè)定pH值。

表2 厭氧發(fā)酵物料的組成 (g)

1.4 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.4.1 秸稈木質(zhì)化

采用FOSS Fibertec 2010全自動(dòng)纖維分析儀(FOSS，瑞典)，參照范氏(Van Soest)洗滌纖維法測(cè)定馬鈴薯莖葉的中性洗滌纖維(NDF)含量[16]。

1.4.2 沼氣產(chǎn)量

采用濕式氣體流量計(jì)(TG1，Ritter，德國(guó))測(cè)定沼氣產(chǎn)量。

1.4.3 沼氣成分

采用氣相色譜儀(GC1100，普析，北京)測(cè)定CH4的百分含量，色譜方法為：載氣使用高純H2；熱導(dǎo)檢測(cè)器(TCD 檢測(cè)器)；設(shè)置進(jìn)樣口和檢測(cè)器溫度分別為110℃和150℃；色譜柱采用填充色譜柱(TDX-01，島津，日本)，柱箱程序升溫，初始溫度為40℃，保持2 min后以10℃·min-1速度升溫至80℃并保持1min。

1.4.4 其他指標(biāo)

TS，VS，pH值均按照《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》所述方法進(jìn)行測(cè)定[17]；WSC測(cè)定采用硫酸-蒽酮比色法[18]；CP采用凱氏定氮儀測(cè)定(Kjel master K-375，BUCHI，瑞士)；EE采用乙醚索氏抽提法測(cè)定[19]；TC和TN采用總有機(jī)碳/有機(jī)氮分析儀(multi C/N TOC，耶拿，德國(guó))測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 風(fēng)干時(shí)間對(duì)馬鈴薯莖葉成分的影響

風(fēng)干時(shí)間對(duì)馬鈴薯莖葉成分的影響如表3所示。馬鈴薯塊莖收獲時(shí)，植株發(fā)黃凋萎現(xiàn)象并不嚴(yán)重，其莖葉部分的含水量仍然較高，本研究所使用新鮮馬鈴薯莖葉的初始干物質(zhì)含量為13.58%，與楊永在、韋國(guó)杰、楊聞文等的研究結(jié)果接近[5，20-21]。隨風(fēng)干時(shí)間的延長(zhǎng)，馬鈴薯莖葉含水率逐漸降低，干物質(zhì)含量逐漸升高，風(fēng)干96 h時(shí)干物質(zhì)含量達(dá)到44.06%。風(fēng)干前期馬鈴薯莖葉失水速度較快，而后期則逐漸減慢，這可能是由于風(fēng)干前期馬鈴薯莖葉細(xì)胞呼吸作用、蒸騰作用等生理活動(dòng)仍然旺盛，此時(shí)主要失去的是大量細(xì)胞游離水；而風(fēng)干后期細(xì)胞逐漸失活，細(xì)胞結(jié)構(gòu)水逐漸流失。

表3 馬鈴薯莖葉成分隨風(fēng)干時(shí)間的變化

新鮮馬鈴薯莖葉含有豐富的可溶性碳水化合物(WSC)、粗蛋白(CP)和粗脂肪(EE)等營(yíng)養(yǎng)成分，本研究中新鮮馬鈴薯莖葉中WSC，CP，EE初始含量分別為5.16%，18.20%和4.25%，相較于厭氧沼氣發(fā)酵中常用的玉米秸稈，馬鈴薯莖葉CP含量顯著較高，WSC則顯著較低，EE含量則較為接近[22-24]。隨自然風(fēng)干的進(jìn)行，馬鈴薯莖葉WSC，CP，EE含量均有一定程度降低，風(fēng)干96 h時(shí)分別降至3.95%，14.37%和3.04%，降低幅度分別達(dá)23.45%，21.04%和28.47%。同失水情況相類(lèi)似的是，整個(gè)風(fēng)干過(guò)程中WSC，CP，EE的減少速度逐漸放緩，這與植物細(xì)胞各種代謝活動(dòng)逐漸減弱存在直接的聯(lián)系[25]，同時(shí)由于水活度的降低，植株表面的土著微生物也更加難以生存。

NDF為植株中半纖維素、纖維素、木質(zhì)素和灰分等難降解細(xì)胞結(jié)構(gòu)組分的總和，較難被植物細(xì)胞自身和環(huán)境微生物分解，可在一定程度上代表植株的木質(zhì)纖維化程度。自然風(fēng)干過(guò)程中，在水分逐漸喪失，WSC，CP，EE等易分解有機(jī)物含量逐漸降低的同時(shí)，馬鈴薯莖葉中NDF含量卻有所增加。實(shí)驗(yàn)中，風(fēng)干96 h時(shí)NDF含量達(dá)到47.08%，比新鮮馬鈴薯莖葉高8.55%，這一方面是由于WSC等易分解有機(jī)物含量的降低而使得NDF含量相對(duì)升高；另一方面，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，木質(zhì)纖維聚合度、結(jié)晶度逐漸提高，纖維素、半纖維素、木質(zhì)素分子交聯(lián)更加緊密，也更難以被微生物所利用[26]。探索合適的風(fēng)干時(shí)間，對(duì)于馬鈴薯莖葉的資源化利用是十分必要的。

2.2 厭氧發(fā)酵日產(chǎn)氣量

對(duì)厭氧發(fā)酵過(guò)程中日產(chǎn)氣量的變化進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如圖1所示。除只含有接種物的對(duì)照組T0外，實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)各處理組均出現(xiàn)多個(gè)產(chǎn)氣高峰，且在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后第1天即迅速出現(xiàn)顯著的“產(chǎn)氣高峰”，產(chǎn)氣量分別達(dá)1.45 L·d-1，1.32 L·d-1，1.24 L·d-1，1.30 L·d-1和1.15 L·d-1，均為各處理組日產(chǎn)氣量最高峰。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)氣體的大量產(chǎn)生主要由馬鈴薯莖葉自身細(xì)胞生理活動(dòng)、微生物分解代謝、蛋白酶活性作用等因素造成[27-28]，結(jié)合圖3可以發(fā)現(xiàn)，此時(shí)產(chǎn)生的氣體中甲烷含量很低，且在第1天后各組產(chǎn)氣量均迅速降低，說(shuō)明發(fā)酵體系尚未進(jìn)入?yún)捬醢l(fā)酵的產(chǎn)甲烷階段，此“產(chǎn)氣高峰”并非真正的沼氣產(chǎn)生高峰。

真正沼氣產(chǎn)生高峰出現(xiàn)時(shí)，甲烷達(dá)到較高濃度。從圖1可以發(fā)現(xiàn)，第1產(chǎn)氣高峰出現(xiàn)時(shí)間隨馬鈴薯莖葉風(fēng)干程度加深而逐漸推遲：T1組(新鮮馬鈴薯莖葉)第1產(chǎn)氣高峰出現(xiàn)時(shí)間最早，第6天時(shí)沼氣日產(chǎn)量達(dá)1.17 L·d-1；T2組(風(fēng)干24 h馬鈴薯莖葉)第1產(chǎn)氣高峰出現(xiàn)在第10天，達(dá)1.02 L·d-1；T3組(風(fēng)干48 h馬鈴薯莖葉)第1產(chǎn)氣高峰出現(xiàn)在第13天，達(dá)1.04 L·d-1；T4組(風(fēng)干72 h馬鈴薯莖葉)第1產(chǎn)氣高峰出現(xiàn)在第14天，為0.86 L·d-1；T5組(風(fēng)干96 h馬鈴薯莖葉)第1產(chǎn)氣高峰出現(xiàn)時(shí)間最晚，第15天時(shí)沼氣日產(chǎn)量為0.86 L·d-1。植物材料風(fēng)干程度越高，WSC，CP，EE等易被發(fā)酵微生物快速利用的成分損耗越多，NDF含量增加，同時(shí)植物材料含有的土著微生物數(shù)量也因水活度的降低而減少，一般而言原料木質(zhì)化程度越深，則厭氧發(fā)酵啟動(dòng)越緩慢[29-31]。

圖1 厭氧發(fā)酵日產(chǎn)氣量

各處理組在第1產(chǎn)氣高峰出現(xiàn)后，隨發(fā)酵時(shí)間延續(xù)均又出現(xiàn)1～2個(gè)次產(chǎn)氣高峰。T1，T2，T3，T4和T5處理組分別在第23、27、28、32天和31天出現(xiàn)5次產(chǎn)氣高峰，5次產(chǎn)氣高峰產(chǎn)氣量分別為0.58 L·d-1，0.79 L·d-1，0.89 L·d-1，0.66 L·d-1和0.56 L·d-1。可以發(fā)現(xiàn)除T4組外，隨原料風(fēng)干程度的加深，各處理組次產(chǎn)氣高峰出現(xiàn)時(shí)間依次延后，與第1產(chǎn)氣高峰的出現(xiàn)順序基本一致。多項(xiàng)研究指出，秸稈類(lèi)植物原料厭氧發(fā)酵時(shí)會(huì)出現(xiàn)不止一個(gè)產(chǎn)氣高峰，本研究結(jié)果符合這一規(guī)律[29-30]。每次產(chǎn)氣高峰的產(chǎn)生往往是由于發(fā)酵原料中半纖維素、纖維素等難降解成分經(jīng)多種微生物的復(fù)雜生理代謝，逐漸被分解利用的緣故。發(fā)酵原料風(fēng)干程度越高則木質(zhì)纖維化程度越高、微觀結(jié)構(gòu)越緊密，微生物菌群?jiǎn)?dòng)發(fā)酵所需時(shí)間越長(zhǎng)，而每次產(chǎn)氣高峰出現(xiàn)時(shí)間則越晚。值得注意的是相對(duì)于其它各組，T2組和T3組每次次產(chǎn)氣高峰維持時(shí)間較長(zhǎng)，表現(xiàn)為一個(gè)高產(chǎn)氣“平臺(tái)期”，能夠產(chǎn)生更多的甲烷，這可能與T2組和T3組發(fā)酵體系pH值、揮發(fā)性脂肪酸、微生物菌群等關(guān)鍵發(fā)酵指標(biāo)達(dá)到了較好的平衡有關(guān)。

2.3 厭氧發(fā)酵累積產(chǎn)氣量和TS產(chǎn)氣率

以不同風(fēng)干時(shí)間的馬鈴薯莖葉為原料進(jìn)行厭氧發(fā)酵時(shí)，各處理組累積產(chǎn)氣量的變化如圖2所示。在40 d的實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，T1，T2，T3，T4和T5組累積產(chǎn)氣量分別為：20.21 L，23.67 L，26.05 L，16.29 L和12.93 L，其中原料風(fēng)干時(shí)間48 h的T3組最高，原料風(fēng)干時(shí)間96 h的T5組最低，T3組累積產(chǎn)氣量為T(mén)5組的2.01倍。雖然在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，原料風(fēng)干時(shí)間與厭氧發(fā)酵累積產(chǎn)氣量之間不存在簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，但是在厭氧發(fā)酵的前中期(前23 d)，卻可發(fā)現(xiàn)原料風(fēng)干時(shí)間越短則累積產(chǎn)氣量越高的現(xiàn)象。由于發(fā)酵前中期沼氣主要由原料中WSC，CP，EE等易利用組分發(fā)酵產(chǎn)生，風(fēng)干時(shí)間越短則這些易利用組分保留越多，因而產(chǎn)氣量越高，這也與各處理組第1產(chǎn)氣高峰的出現(xiàn)順序基本吻合；而在發(fā)酵的中后期(23 d后)，隨著原料中易利用組分的耗盡，沼氣微生物菌群主要依靠較難分解的半纖維素、纖維素等產(chǎn)生沼氣，此時(shí)原料風(fēng)干時(shí)間分別為24 h和48 h的T2，T3組產(chǎn)氣量逐漸后來(lái)居上，累積產(chǎn)氣量明顯高于其它各組。該現(xiàn)象說(shuō)明發(fā)酵中后期沼氣的產(chǎn)生受多種因素影響，并不完全取決于原料的木質(zhì)化程度，還與發(fā)酵環(huán)境酸堿平衡、揮發(fā)性脂肪酸濃度、微生物群落構(gòu)成等多種因素有關(guān)。TS產(chǎn)氣率可以反映不同物料在發(fā)酵周期內(nèi)的沼氣轉(zhuǎn)化效率，一般TS產(chǎn)氣率越高，則代表物料產(chǎn)氣潛力越大。綜合來(lái)看，本研究中扣除只含接種物的對(duì)照組T0產(chǎn)氣量后，T1，T2，T3，T4和T5各組TS產(chǎn)氣率分別為193.30 mL·g-1，227.90 mL·g-1，251.70 mL·g-1，154.10 mL·g-1和120.50 mL·g-1，其中以風(fēng)干48 h馬鈴薯莖葉為原料的T3組TS產(chǎn)氣率最高，產(chǎn)氣效果較好。對(duì)馬鈴薯莖葉進(jìn)行48 h左右的自然風(fēng)干、降低含水率，雖然WSC，CP，EE等含量相對(duì)新鮮莖葉有所下降，木質(zhì)化程度有一定提高，但是用于厭氧沼氣發(fā)酵卻可以取得較優(yōu)的產(chǎn)氣效果。

圖2 厭氧發(fā)酵累積產(chǎn)氣量

2.4 厭氧發(fā)酵過(guò)程甲烷含量變化

如圖3所示，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始一段時(shí)間內(nèi)，各處理組甲烷含量均能提升到50%(體積分?jǐn)?shù))以上，在實(shí)驗(yàn)中后期略有下降但仍基本保持穩(wěn)定，T1，T2，T3，T4和T5組甲烷含量達(dá)到或超過(guò)50%所需時(shí)間分別為：7 d，8 d，9 d，10 d和11 d，可見(jiàn)馬鈴薯莖葉風(fēng)干時(shí)間越長(zhǎng)則厭氧發(fā)酵甲烷濃度提升越緩慢，但是各組彼此差異并不明顯；同時(shí)，實(shí)驗(yàn)條件下各處理組所能達(dá)到的最高甲烷含量較為接近，T1，T2，T3，T4和T5組最高甲烷含量分別為：55.05%，54.68%，54.62%，53.55%和53.60%，說(shuō)明原料風(fēng)干程度的差異對(duì)沼氣的最高甲烷含量影響不大。另外，在40 d的厭氧發(fā)酵周期內(nèi)，盡管各處理組產(chǎn)氣量和產(chǎn)氣效率存在較大差異，但均能達(dá)到較高的甲烷濃度并保持相對(duì)穩(wěn)定，可認(rèn)為實(shí)驗(yàn)條件下各處理組均能成功發(fā)酵產(chǎn)氣，即新鮮和風(fēng)干24 h,48 h,72 h,96 h的馬鈴薯莖葉均可用于厭氧發(fā)酵沼氣生產(chǎn)之中。

圖3 厭氧發(fā)酵甲烷含量變化

2.5 厭氧發(fā)酵過(guò)程pH值變化

按照經(jīng)典的厭氧沼氣發(fā)酵三階段理論，物料的厭氧消化主要分為“水解液化”、“產(chǎn)酸”和“產(chǎn)甲烷”3個(gè)階段，即多糖、蛋白質(zhì)大分子有機(jī)物在復(fù)雜微生物菌群的作用下，首先分解為單糖、氨基酸等小分子有機(jī)物，隨后轉(zhuǎn)變?yōu)楸?、丁酸等多種有機(jī)酸和CO2，最后生成CH4。3個(gè)階段緊密銜接，每個(gè)階段各有發(fā)酵細(xì)菌、產(chǎn)酸細(xì)菌、產(chǎn)甲烷菌等不同種類(lèi)的微生物發(fā)揮關(guān)鍵性作用[32-33]。不同種類(lèi)的微生物生存生長(zhǎng)所需的最適環(huán)境pH值是不同的，但總體而言偏近于中性，WuQ L[34]等認(rèn)為pH值低于5.0時(shí)產(chǎn)甲烷菌活性會(huì)受到完全的抑制，因此確保發(fā)酵體系酸堿平衡是保證正常產(chǎn)氣的必要條件。本研究每隔3 d對(duì)發(fā)酵過(guò)程中各組pH值變化進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果如圖4所示。整體來(lái)看，除T0對(duì)照組外，各處理組pH值均呈“迅速降低-升高-小幅降低-升高-穩(wěn)定”的“W”型變化趨勢(shì)。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始的3～6 d，T1，T2，T3，T4和T5組均達(dá)到發(fā)酵過(guò)程的最低pH值，各組最低pH值隨原料風(fēng)干程度增加而逐漸升高，分別為5.92，6.05，6.12，6.24和6.48，這與原料風(fēng)干程度越高，則WSC，CP等易利用組分含量降低，而木質(zhì)纖維化程度升高有關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道，以蔬菜廢棄物、餐廚垃圾等易腐敗原料進(jìn)行厭氧發(fā)酵時(shí)，可能由于糖類(lèi)、蛋白質(zhì)等易利用組分被微生物過(guò)快水解而生成大量有機(jī)酸，pH值迅速下降，超出發(fā)酵體系緩沖范圍和產(chǎn)甲烷菌利用有機(jī)酸能力而出現(xiàn)“過(guò)酸化”現(xiàn)象，毒害整個(gè)沼氣發(fā)酵微生物菌群而導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)氣失敗[35-36]。雖然實(shí)驗(yàn)開(kāi)始階段各組pH值降低幅度較大，但結(jié)合日產(chǎn)氣曲線(見(jiàn)圖1)來(lái)看各組均開(kāi)始正常產(chǎn)氣，未出現(xiàn)“過(guò)酸化”現(xiàn)象，說(shuō)明此時(shí)的pH值仍在發(fā)酵體系的緩沖范圍和產(chǎn)甲烷菌等功能微生物耐受范圍之內(nèi)。

圖4 厭氧發(fā)酵過(guò)程中pH值的變化

3 討論與結(jié)論

利用馬鈴薯莖葉等生物質(zhì)資源厭氧發(fā)酵生產(chǎn)沼氣，是實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)廢棄物資源化利用的重要方式。但新鮮莖葉含水量高、易腐敗變質(zhì)，干秸稈則木質(zhì)化程度太深、可生化性較差，為解決該問(wèn)題，筆者研究了自然風(fēng)干對(duì)馬鈴薯莖葉營(yíng)養(yǎng)成分和厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣性能的影響。

厭氧沼氣發(fā)酵是一個(gè)微生物主導(dǎo)的復(fù)雜生化過(guò)程，其中底物的可生化性直接關(guān)系著產(chǎn)氣性能的高低。經(jīng)分析測(cè)定，本研究中新鮮馬鈴薯莖葉中可溶性碳水化合物、粗蛋白、粗脂肪和中性洗滌纖維的含量分別為5.16%，18.20%，4.25%和43.37%，其中可溶性碳水化合物、粗蛋白、粗脂肪屬于易利用組分，在發(fā)酵中優(yōu)先被微生物分解利用；而中性洗滌纖維涵蓋了纖維素、半纖維素等難降解成分，屬難利用組分，一般在易利用組分耗盡后才逐漸得到分解利用。隨風(fēng)干時(shí)間的延長(zhǎng)，由于植物細(xì)胞本身的生理代謝、老化死亡等因素，莖葉水分逐漸流失，可溶性碳水化合物、粗蛋白、粗脂肪等逐漸減少，而中性洗滌纖維含量逐漸升高，即整體呈現(xiàn)易利用組分減少而難利用組分升高的現(xiàn)象。顯然，沼氣發(fā)酵微生物對(duì)易利用組分的利用順序優(yōu)于難利用組分，該現(xiàn)象類(lèi)似于微生物發(fā)酵中廣泛存在的葡萄糖對(duì)乳糖、乙醇等其它底物抑制的“葡萄糖效應(yīng)”[38]。風(fēng)干時(shí)間通過(guò)影響易利用組分、難利用組分的含量，間接影響了厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣的啟動(dòng)速度，本研究中，新鮮莖葉，風(fēng)干24 h，48 h，72 h和96 h的馬鈴薯莖葉處理組到達(dá)第1產(chǎn)氣高峰的時(shí)間分別為第6、10、13、14天和15天，符合“易利用組分含量越高，則厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣啟動(dòng)速度越快”的規(guī)律。

但是，決定物料厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣性能的因素是多方面的，發(fā)酵啟動(dòng)速度只是其中之一。相對(duì)而言，累積產(chǎn)氣量和TS產(chǎn)氣率分別可以反映不同物料在發(fā)酵周期內(nèi)的總產(chǎn)氣量和沼氣轉(zhuǎn)化效率，也是十分重要的指標(biāo)。由于多數(shù)沼氣微生物生存的最適pH值接近于中性，健康的發(fā)酵體系應(yīng)是酸堿平衡的體系，而底物中若易利用組分過(guò)多，分解過(guò)快，導(dǎo)致?lián)]發(fā)性脂肪酸等有機(jī)酸積累太多，雖然不一定達(dá)到“過(guò)酸化”的程度，但是也會(huì)一定程度上抑制多種功能微生物，特別是產(chǎn)甲烷菌的活性。本研究中，可以發(fā)現(xiàn)，以風(fēng)干48 h馬鈴薯莖葉為原料的T3組TS產(chǎn)氣率最高，為251.70 mL·g-1，高于新鮮莖葉組30.21%，是實(shí)驗(yàn)設(shè)置條件下的最優(yōu)產(chǎn)氣組。結(jié)合發(fā)酵過(guò)程中pH值的變化(見(jiàn)圖4)可以發(fā)現(xiàn)，以新鮮莖葉為原料時(shí)，體系所達(dá)到的最低pH值為5.92，最終pH值為7.70；而以風(fēng)干48 h馬鈴薯莖葉為原料時(shí)，體系所達(dá)到的最低pH值為6.12，最終pH值為8.08，均高于新鮮莖葉組，較為平穩(wěn)的酸堿環(huán)境可能對(duì)發(fā)酵微生物菌群沖擊較小。此外，隨著發(fā)酵過(guò)程的進(jìn)行，更多的木質(zhì)纖維素等難利用組分逐漸被轉(zhuǎn)化利用，表現(xiàn)為多個(gè)產(chǎn)氣高峰的出現(xiàn)，這也是適當(dāng)風(fēng)干后的馬鈴薯莖葉產(chǎn)沼氣性能優(yōu)于新鮮馬鈴薯莖葉的原因之一。良好的酸堿平衡、揮發(fā)性脂肪酸等重要中間產(chǎn)物的穩(wěn)定產(chǎn)生和消耗、及發(fā)酵微生物菌群的平穩(wěn)演化，都是保障系統(tǒng)較高產(chǎn)氣性能的重要條件。后續(xù)可以通過(guò)菌群高容量DNA測(cè)序、實(shí)時(shí)熒光活性分析等手段對(duì)發(fā)酵過(guò)程中各功能微生物菌群數(shù)量和活性變化等進(jìn)行檢測(cè)。

本研究的具體結(jié)論如下：

(1)風(fēng)干時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)馬鈴薯莖葉成分有顯著影響：風(fēng)干時(shí)間越久，則可溶性碳水化合物、粗蛋白、粗脂肪等易利用組分含量越低，中性洗滌纖維等難利用組分含量越高。

(2)風(fēng)干時(shí)間顯著影響馬鈴薯莖葉厭氧發(fā)酵啟動(dòng)速度，風(fēng)干時(shí)間越久則啟動(dòng)越慢；實(shí)驗(yàn)中可能出現(xiàn)多個(gè)產(chǎn)氣高峰，這與微生物對(duì)原料中不同組分利用的難易程度有關(guān)；風(fēng)干時(shí)間對(duì)產(chǎn)氣甲烷濃度影響不大，各處理組甲烷濃度均可達(dá)50%以上并保持相對(duì)穩(wěn)定；累積TS產(chǎn)氣率并不完全取決于風(fēng)干程度，各處理累積TS產(chǎn)氣率由高到低依次為：48 h風(fēng)干莖葉、24 h風(fēng)干莖葉、新鮮莖葉、72 h風(fēng)干莖葉和96 h風(fēng)干莖葉。

(3)馬鈴薯莖葉可作為合適的厭氧發(fā)酵原料，在35℃中溫條件下進(jìn)行40 d的批式厭氧發(fā)酵，累積TS產(chǎn)氣率最高可達(dá)251.70 mL·g-1。鑒于風(fēng)干時(shí)間對(duì)馬鈴薯莖葉產(chǎn)沼氣效率的重要影響，實(shí)踐中可選擇對(duì)原料進(jìn)行48 h左右的自然風(fēng)干，降低含水率，既方便貯存、避免腐敗變質(zhì)，又可一定程度上增加沼氣產(chǎn)量，提高原料利用率。