孔 萌，黃 彬，石劍飛，彭明國(guó)，何 方，毛林強(qiáng)，張文藝

(1.常州大學(xué) 環(huán)境與安全工程學(xué)院，江蘇 常州 213164；2.江蘇中東化肥股份有限公司，江蘇 常州 213153；3.武農(nóng)生態(tài)能源有限公司，江蘇 常州 213165)

氯酚類化合物是一種具有“致癌、致畸、致突變”效應(yīng)的持久性有機(jī)污染物，廣泛存在于土壤、地表水、地下水中，其潛在風(fēng)險(xiǎn)備受關(guān)注。農(nóng)藥及化學(xué)肥料的肆意使用，嚴(yán)重影響了土壤的微生態(tài)環(huán)境，加上我國(guó)大多數(shù)地區(qū)作物連作制度，致使土壤板結(jié)、營(yíng)養(yǎng)元素虧缺、質(zhì)地惡化、微生物群落變遷等情況日益嚴(yán)重。近年來，處理氯酚類化合物污染的方法主要集中在生物處理技術(shù)、物理化學(xué)法、化學(xué)還原法和化學(xué)氧化法[1]。其中微生物修復(fù)有機(jī)氯農(nóng)藥污染土壤具有成本低、修復(fù)效率高、二次污染效應(yīng)小等特點(diǎn)，受到廣泛的關(guān)注[2]。唐晨[3]歸納討論了生物降解酚類化合物的機(jī)制及影響因素，而范燕燕[4]的研究則證實(shí)了微生物降解氯酚類化合物的有效性。沼渣除了含有大量的氮、磷、鉀營(yíng)養(yǎng)元素還有植物生長(zhǎng)必須的氨基酸、生長(zhǎng)素、腐殖酸等，不僅對(duì)提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)有良好的作用[5-7]，還能夠改良土壤的理化性質(zhì)[8-9]，增加微生物的活性。本課題組前期將微生物與沼渣結(jié)合制備出沼渣生物菌肥[10-11]，對(duì)2,4-DCP污染土壤具有較好的改良效果。

錢家忠、董繼元等曾研究沼液對(duì)水環(huán)境潛在的生態(tài)危害進(jìn)行了健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)[12-14]，但對(duì)于農(nóng)田土壤污染潛在的人群健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的研究尚未見報(bào)導(dǎo)。生物毒性檢測(cè)是一種化學(xué)污染物檢測(cè)的補(bǔ)充[15]，可以有效直觀的反映受污染土壤毒性，從而體現(xiàn)污染物對(duì)于人類健康和生態(tài)環(huán)境的影響。有研究對(duì)廢棄農(nóng)藥廠污染場(chǎng)地土壤浸出液進(jìn)行生物毒性檢測(cè)證明生物毒性測(cè)試法可以運(yùn)用于污染土壤浸出液的毒性評(píng)價(jià)[16]。美國(guó)環(huán)境保護(hù)所(USPEA)健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)模型曾被用于評(píng)價(jià)鎘污染對(duì)不同人群暴露的健康風(fēng)險(xiǎn)[17]。為了確保居民的健康與安全，對(duì)改良土壤進(jìn)行生物毒性檢測(cè)和健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)是十分有必要的。目前，國(guó)內(nèi)外大多研究集中于沼渣作為有機(jī)肥對(duì)土壤養(yǎng)分含量、生態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，但對(duì)生物菌劑協(xié)同沼渣制備生物菌有機(jī)復(fù)合肥，對(duì)降解農(nóng)藥污染土壤毒性報(bào)道較少。本課題組基于生物菌-沼渣協(xié)同改良受污染土壤研究基礎(chǔ)，對(duì)修復(fù)后的土壤進(jìn)行急性毒性與健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)研究。

本研究以受2,4-DCP污染的農(nóng)田土壤為研究對(duì)象，通過添加本課題組制備的HD-1沼渣生物菌肥和菌液[18]，利用發(fā)光菌法對(duì)改良后土壤浸提液毒性以及土壤中種植的水稻、花生果實(shí)浸提液毒性進(jìn)行分析，考察施用生物菌有機(jī)復(fù)合肥對(duì)改良后農(nóng)田土壤對(duì)人群健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的影響，為農(nóng)藥污染土壤的改良和生態(tài)系統(tǒng)的構(gòu)建提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

菌種來源：農(nóng)殘降解菌HD-1篩選自南京某廢棄農(nóng)藥廠的土壤中，是一株具有降解2,4-DCP能力的菌，經(jīng)過理化特性和分子鑒定判斷屬于摩式假單胞菌?，F(xiàn)保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。保藏編號(hào)：CGMCC NO.15123。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，氯化鈉5.0 g，蒸餾水1 L，pH值7.0，121℃，100 kPa上海申安立式壓力蒸汽滅菌器(LDZX-50KBS)高溫滅菌20 min后使用。

干燥污泥磷酸銨鎂(MgNH4PO4·6H2O簡(jiǎn)稱MAP)：將分散式養(yǎng)豬場(chǎng)沼液通過磷酸銨鎂結(jié)晶法制備MAP[10]。

改性沸石：采用經(jīng)NaCl溶液改性后的斜發(fā)沸石，理化參數(shù)：粒徑1～3 mm，孔隙率30%～40%，比表面積25～35 m2·g-1，平均吸附孔徑4.36 nm。將改性后的斜發(fā)沸石對(duì)MAP結(jié)晶法處理后的沼液進(jìn)行吸附，吸附比10 g·100 mL-1，得到含氮、磷的斜發(fā)沸石。

沼渣：將分散式養(yǎng)豬場(chǎng)沼渣進(jìn)行150℃高溫干燥72 h，剔除雜質(zhì)，使用上海福絮鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9620A)達(dá)到干燥效果。

包膜材料：取一定量蒸餾水加熱至約90℃后加入聚乙烯醇不停攪拌，保溫?cái)嚢柚疗渫耆芙?，制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的聚乙烯醇溶液，密封保存冷卻至室溫。

1.2 菌液和菌肥的制備

(1)HD-1菌液制備：將配置好的LB培養(yǎng)基放入高壓蒸汽滅菌鍋121℃，滅菌20 min，待冷卻到約30℃時(shí)，將菌種轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基中，于30℃，130 r·min-1上海一恒恒溫振蕩培養(yǎng)箱(HZQ-X100A)中震蕩3 d。

(2)沼渣生物菌肥的制備：將上述MAP，改性沸石，沼渣進(jìn)行研磨，并過60目篩網(wǎng)。將1 gMAP，4 g改性沸石，25 g沼渣與對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HD-1菌液混合、造粒，控制粒徑范圍4～6 mm,使得有效活菌數(shù)大于0.2 cfu·g-1，再將6.0 mL 8%聚乙烯醇作為封面材料均勻包裹在復(fù)混肥表面，復(fù)混比0.2 mL·g-1，待35℃烘干后為生物菌復(fù)混肥成品。

(3)模擬2,4-DCP受污染土壤：取適量未滅菌農(nóng)田土，自然風(fēng)干，過60目篩，制備2,4-DCP濃度為30 mg·kg-1。

1.3 發(fā)光細(xì)菌急性毒性測(cè)定

(1)取兩份400 g 2,4-DCP濃度為30 mg·kg-1的土壤，其中一份加入267 mL的HD-1菌液及10 g沼渣生物菌肥，另一份為空白，使得含水率為40%，每隔兩天取10 g土壤于50 mL離心管中，加入40 mL蒸餾水，超聲波提取30 min，4000 r·min-1條件下離心20 min，取上清液過0.45 μm針孔過濾器，得到不同時(shí)間段的浸提液樣品。超聲波提取使用寧波新芝超聲波清洗機(jī)(SB-5200D)，離心機(jī)使用金壇市杰瑞爾臺(tái)式大型離心機(jī)(XYJ-A)。

(2)將在施加30 g沼渣生物菌肥的土壤里種植的盆栽水稻、花生果實(shí)碾碎分別取5 g浸入100 mL無菌蒸餾水中，超聲波萃取30 min，4000 r·min-1條件下離心20 min，取上清液過0.45 μm針孔過濾器，得到果實(shí)浸提液樣品。

將浸提樣品分別通過北京金達(dá)JQ LID-P1發(fā)光細(xì)菌毒性檢測(cè)分析儀檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果以抑光率公式(1)表示：

1.4 盆栽實(shí)驗(yàn)栽種

盆栽實(shí)驗(yàn)農(nóng)作物有水稻、玉米、花生、紅薯等，盆栽分別施加市售復(fù)合肥和沼渣生物菌肥，并設(shè)置平行對(duì)照組。盆栽實(shí)驗(yàn)在室外進(jìn)行，種植農(nóng)作物的器皿為陶瓷盆，土壤層厚度為25 cm，農(nóng)作物秧苗采自常州市洛陽鎮(zhèn)農(nóng)田。實(shí)驗(yàn)前期對(duì)每盆盆栽施加30 g基肥，中后期(1～3個(gè)月)對(duì)照盆栽每10 d施加沼渣生物菌肥、市售復(fù)合肥15 g，施加4次。

1.5 土壤樣品主要污染物產(chǎn)物檢測(cè)

2,4-DCP在土壤中濃度的測(cè)定：配置一定濃度的2,4-DCP土壤，攪拌均勻后，取10 g土壤于50 mL離心管中，加入一定量的蒸餾水使其含水率為40%，超聲波提取30 min，4000 r·min-1條件下離心20 min，取上清液過0.45 μm針孔過濾器，轉(zhuǎn)入試劑瓶通過日本島津紫外分光光度計(jì)(UV1800)檢測(cè)。

菌種在土壤中降解能力的測(cè)定：取200 g土壤加入135 mL菌液，保持含水率為40%，不加菌做空白樣，按照土壤測(cè)定方法每天檢測(cè)。

南京索益盟檢測(cè)技術(shù)有限公司檢測(cè)土壤中污染物方法：氣相色譜氣質(zhì)聯(lián)用法測(cè)土壤中的酚類化合物[19-20]。

1.6 污染土壤健康風(fēng)險(xiǎn)模型構(gòu)建

土壤中污染物進(jìn)入人體主要暴露途徑有皮膚接觸、呼吸攝入及經(jīng)口攝入。不同污染物經(jīng)過不同途徑對(duì)人體產(chǎn)生危害所引起的健康風(fēng)險(xiǎn)模型分為致癌物健康風(fēng)險(xiǎn)模型和非致癌物健康風(fēng)險(xiǎn)模型[21-24]。

根據(jù)《污染場(chǎng)地風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估技術(shù)導(dǎo)則》，污染物致癌風(fēng)險(xiǎn)為10-6，非致癌風(fēng)險(xiǎn)危害商值為1。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用origin9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與討論

2.1 HD-1在土壤中降解性能研究

模擬受污染土壤加入新鮮制備過夜的HD-1菌液，保持土壤含水率為40%，不加菌劑空白對(duì)照組，每隔2 d取10 g土測(cè)定2,4-DCP在土壤中的殘余濃度。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置不加菌劑空白組，以相同時(shí)間處理土壤，不投加HD-1菌的受污染土壤經(jīng)10d改良后，土壤中的2,4-DCP降解率為23.09%，濃度從28.42 mg·kg-1降低到23.25 mg·kg-1，投加HD-1菌的受污染土壤經(jīng)過10 d改良后，降解率為64.16%，殘余濃度由28.01 mg·kg-1降為10.83 mg·kg-1。將投加HD-1菌的受污染土壤又自然降解20 d委托南京索益盟檢測(cè)技術(shù)有限公司進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)2,4-DCP濃度為8.01 mg·kg-1。實(shí)驗(yàn)證明，本文所篩選出的HD-1降解菌可有效修復(fù)2,4-DCP污染土壤。

當(dāng)農(nóng)藥濃度過高時(shí)，微生物降解農(nóng)藥會(huì)發(fā)生吸附和解析過程，即菌株降解農(nóng)藥時(shí)，會(huì)將藥劑先吸附到菌體表面，再轉(zhuǎn)移至菌體體內(nèi)進(jìn)行降解，當(dāng)菌體體內(nèi)農(nóng)藥積攢濃度過高時(shí)，菌體自身會(huì)開啟保護(hù)機(jī)能，將農(nóng)藥排斥出去，防止自身受到傷害，同時(shí)代謝產(chǎn)物也會(huì)使菌體產(chǎn)生生物毒性，從而導(dǎo)致農(nóng)藥降解率逐漸下降[25](如圖1)。

圖1 加菌與未加菌對(duì)土壤中2,4-DCP的降解效果

2.2 施加菌液后土壤浸提液急性毒性分析

發(fā)光細(xì)菌是一類在正常生理?xiàng)l件下可以發(fā)射熒光的細(xì)菌，用于監(jiān)測(cè)樣品中毒性的一種生物測(cè)試技術(shù)。運(yùn)用具有發(fā)光特性的天然微生物，樣品中的毒性物質(zhì)具有抑制微生物發(fā)光的作用，毒性越強(qiáng)這種抑制作用越明顯。韋淑穩(wěn)[26]等曾用發(fā)光細(xì)菌法用于檢測(cè)農(nóng)藥污染毒性，并提出了發(fā)光細(xì)菌法在農(nóng)藥與其他多重污染物毒性檢測(cè)中的應(yīng)用前景。發(fā)光細(xì)菌急性毒性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)南京土壤研究所推薦的百分?jǐn)?shù)等級(jí)分?jǐn)?shù)標(biāo)準(zhǔn)見表1[27]。

表1 發(fā)光細(xì)菌急性毒性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

圖2顯示了經(jīng)過15 min浸提之后受污染原土、未稀釋和稀釋10倍的土壤浸提液對(duì)發(fā)光細(xì)菌發(fā)光抑制情況，由該圖可以看出施加菌液后的土壤隨時(shí)間的增加，其浸提液都對(duì)發(fā)光細(xì)菌的抑制效果呈減弱趨勢(shì)，未稀釋的浸提液在第2天抑光率高達(dá)88.14%，稀釋后的浸提液抑光率為67.17%，未稀釋和稀釋10倍的浸提液在10 d內(nèi)抑光率分別下降到了56.65%和40.19%，自然降解的土壤浸提液其抑光率由89.41%降低到84.50%，抑光率變化不大。施加菌液10 d后的土壤浸提液樣品毒性仍為重毒標(biāo)準(zhǔn)，受污染原土浸提液毒性為劇毒標(biāo)準(zhǔn)。在第8天之前，施加菌液土的抑光率變化不大，第8天到第10天變化明顯，與HD-1菌降解效果變化基本吻合。由此可知，HD-1降解菌有效降解2,4-DCP后，對(duì)土壤毒性起到了降低的作用，證實(shí)了HD-1降解菌的有效性。

圖2 土壤樣品浸提液急性毒性

2.3 農(nóng)作物果實(shí)浸提液發(fā)光細(xì)菌毒性分析

盆栽實(shí)驗(yàn)種植農(nóng)作物有水稻、玉米、花生、紅薯等，選取具有代表性的水稻(桔桿果實(shí))和花生(生長(zhǎng)在土壤中根莖果實(shí))進(jìn)行果實(shí)浸提液發(fā)光細(xì)菌毒性分析。在分別施加市售復(fù)合肥和沼渣生物菌肥的模擬受2,4-DCP污染土壤中種植水稻與花生，果實(shí)成熟后對(duì)果實(shí)長(zhǎng)勢(shì)對(duì)比，果實(shí)浸提液進(jìn)行發(fā)光細(xì)菌毒性分析。由表2可以看出，2,4-DCP污染土壤盆栽實(shí)驗(yàn)中施加市售的復(fù)合肥的水稻長(zhǎng)勢(shì)略好，花生長(zhǎng)勢(shì)相差無幾。盆栽果實(shí)浸提液樣品急性毒性檢測(cè)結(jié)果顯示，水稻、花生的浸提液相對(duì)發(fā)光率均大于90%，毒性級(jí)別為無毒。施加沼渣生物菌肥的盆栽水稻果實(shí)相對(duì)發(fā)光率大于施加市售復(fù)合肥的盆栽，由此可知，水稻與沼渣生物菌肥聯(lián)合對(duì)受2,4-DCP污染土壤的降解效果相對(duì)較好，盆栽花生中土壤降解效果相對(duì)較差?？梢酝茰y(cè)到，水稻水生的生長(zhǎng)環(huán)境更加適合沼渣生物菌肥的釋放作用。水中的微生物群落更加均勻而又豐富，使得沼渣生物菌肥的效果更佳[28]。

表2 盆栽農(nóng)作物生長(zhǎng)情況、果實(shí)浸提液相對(duì)發(fā)光率及毒性級(jí)別

2.4 改良后土壤樣品主要污染物產(chǎn)物分析

將施加菌液后的模擬受污染土壤樣品送至南京索益盟檢測(cè)技術(shù)有限公司檢測(cè)，檢測(cè)主要污染物如表3所示，檢出污染物37種，檢出率71.15%，主要高濃度的污染物有苯酚、萘、2,4-DCP、鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯、鄰苯二甲酸二丁酯、菲、芘等。其中大多數(shù)污染物質(zhì)具有致癌危險(xiǎn)，因此需對(duì)污染的農(nóng)田土壤進(jìn)行毒性分析及健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。改良后污染物中大部分得到有效降低，而鄰苯二甲酸二甲酯、鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯和鄰苯二甲酸二丁酯濃度變高。鄰苯二甲酸二甲酯毒性等級(jí)為低毒，還未有中毒報(bào)道，動(dòng)物經(jīng)口劑量大時(shí)對(duì)腸道等有刺激作用，對(duì)皮膚無刺激和致敏作用。鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯毒性等級(jí)為中毒，口服-大鼠LD50: 30000 mg·kg-1;口服-小鼠LD50: 1500mg·kg-1，皮膚-兔:500 mg·24 h-1為輕度; 眼睛-兔:500 mg輕度。鄰苯二甲酸二丁酯，毒性分級(jí)為中毒，可引起輕度致敏作用，具有中等程度的蓄積作用和輕度刺激作用。受污染土壤經(jīng)過改良后污染物濃度大幅度降低，使得受污染土壤對(duì)環(huán)境影響減小，由此可知，HD-1菌不僅對(duì)土壤中的2,4-DCP具有有效的降解能力，對(duì)苯酚等高毒污染物也具有降解效果，對(duì)萘、菲等低毒污染物也具有一定的降解能力。

表3 土壤樣品中有機(jī)污染物種類及濃度 (μg·kg-1)

2.5 2,4-DCP污染土壤健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)

部分高濃度半揮發(fā)性有機(jī)物通過不同途徑對(duì)人體健康造成的風(fēng)險(xiǎn)高低依次為：經(jīng)口攝入>皮膚接觸>呼吸攝入。以模擬受2,4-DCP污染農(nóng)田土為研究目標(biāo)，部分高濃度污染物致癌、非致癌風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)見表4，土壤中2,4-DCP，2,6-二硝基甲苯、鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯濃度較高對(duì)人體健康危害相對(duì)突出。通常認(rèn)為致癌風(fēng)險(xiǎn)大于10-6，非致癌危害商值大于1，會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生健康風(fēng)險(xiǎn)[26]，2,4-DCP經(jīng)口攝入、皮膚接觸、呼吸攝入土壤非致癌風(fēng)險(xiǎn)分別為2.31×10-2，1.26×10-2，1.61×10-5小于非致癌危害商值1，鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯的致癌風(fēng)險(xiǎn)為2.74×10-8，1.5×10-8，2.15×10-10小于致癌可接受水平10-6，表明經(jīng)過菌液改良后的農(nóng)田土，致癌和非致癌風(fēng)險(xiǎn)極小，為可接受水平，即對(duì)受污染農(nóng)田土進(jìn)行菌液改良的效果顯著。

表4 部分高濃度污染物致癌、非致癌風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)

3 結(jié)論

(1)施加菌液后受2,4-DCP污染土壤浸提液急性毒性降低明顯，原土浸提液毒性為劇毒，施加菌液改良的土壤經(jīng)過10 d降解后，土壤浸提液毒性等級(jí)降低到重毒，在施加沼渣生物菌肥土壤中種植的水稻和花生果實(shí)浸提液毒性等級(jí)為無毒。HD-1菌可以降低土壤中2,4-DCP濃度，水稻與沼渣生物菌肥協(xié)同對(duì)受2,4-DCP污染土壤的降解效果更好，土壤毒性解毒效果更佳。

(2)依據(jù)構(gòu)建的致癌和非致癌健康風(fēng)險(xiǎn)模型，施加菌液改良后的農(nóng)田污染土高濃度污染物2,4-DCP、2,6-二硝基甲苯、鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯的致癌風(fēng)險(xiǎn)分別為2.74×10-8，1.5×10-8，2.15×10-10小于10-6即為可接受水平，非致癌危害商值小于1，致癌和非致癌風(fēng)險(xiǎn)極小。沼渣生物菌肥可用于改良2,4-二氯苯酚污染土壤。