楊艷 張曉潔 馬艷青 韓雨 魏海波 張梅

(1赤峰市醫(yī)院腫瘤內(nèi)三科，內(nèi)蒙古 赤峰市 024000；2赤峰學(xué)院第二附屬醫(yī)院腫瘤科)

近年來，結(jié)直腸癌發(fā)病率和致死率呈上升趨勢〔1〕。外科根治性切除手術(shù)是結(jié)直腸癌臨床治療的主要方法，手術(shù)后癌細(xì)胞的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是手術(shù)失敗的主要原因〔2〕，研究癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移的機制對控制結(jié)直腸癌具有重要意義。長鏈非編碼RNA(lncRNA)被證實在癌癥組織中影響癌細(xì)胞的凋亡、增殖、分化等多個生物過程，是分子靶向治療癌癥的一個新目標(biāo)〔3～5〕。lncRNA PCGEM1是前列腺特異性基因，在前列腺癌組織中異常高表達，可誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞的增殖和遷移〔6〕。眾多研究表明，PCGEM1在上皮性卵巢癌〔7〕、前列腺癌〔8～10〕、胰腺癌〔11〕、骨關(guān)節(jié)滑膜炎〔9〕(OA)組織中都存在異常表達，參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。miRNA發(fā)現(xiàn)于1993年〔12〕，是長19～22個核苷酸的非編碼RNA，參與多種病理生理過程的調(diào)控，人體內(nèi)miRNA的異常表達與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)，特別是在惡性腫瘤的發(fā)生、腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移中起重要作用〔13〕。miR-433在人類腫瘤發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮多種作用。miR-433在膀胱癌〔14〕、肝癌〔15〕細(xì)胞的侵襲和遷移中起重要作用；miR-433-3p能夠抑制食管鱗狀細(xì)胞癌ESCC〔16〕和人膠質(zhì)瘤細(xì)胞〔17〕的增殖、遷移和侵襲。然而PCGEM1和miR-433-3p在結(jié)直腸癌中的表達和作用尚未可知。本研究以結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞為研究對象，探討PCGEM1影響HT-29細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的分子機制，為結(jié)直腸癌的術(shù)后分子靶向治療提供新靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1材料 人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT-29和人正常結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞株NCM460購自ATCC；胎牛血清(FBS)和RPMI1640培養(yǎng)基購自Gibco公司，牛血清白蛋白(BSA)、四甲基偶氮唑藍(MTT)、二甲基亞礬(DMSO)和胰蛋白酶Trypsin購自Sigma-Aldrich公司；Transwell板購自美國Corning公司；雙熒光素酶報告系統(tǒng)購自美國Promega公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、總RNA提取試劑盒、 real-time PCR 試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RT-PCR)購自美國Invitrogen公司；光學(xué)顯微鏡、全自動酶標(biāo)儀及real-time PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 配制細(xì)胞培養(yǎng)液：10% FBS+RPMI1640培養(yǎng)基+1×105U/L 青霉素+100 mg/L 鏈霉素，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時，洗滌消化傳代。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 培養(yǎng)HT-29細(xì)胞至對數(shù)生長期，用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞濃度至1×106個/ml，200 μl/孔接種于6孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)至基本融合為一層時按照Lipofectamine 2000說明書進行轉(zhuǎn)染。先用無血清OptiMEM培養(yǎng)液稀釋Lipofectamine 2000、si-NC、si-PCGEM1、miR-NC、miR-433-3p、pcDNA、pcDNA-PCGEM、si-PCGEM1+anti-miR-NC、si-PCGEM1+anti-miR-433-3p、WT-PCGEM1+miR-NC、WT-PCGEM1+miR-433-3p、MUT-PCGEM1+miR-NC和MUT-PCGEM1+miR-433-3p的載體，之后取等體積Lipofectamine 2000和各組載體混合，輕柔混勻后室溫孵育20 min，將混合液滴入到培養(yǎng)好的細(xì)胞孔板中，邊滴加邊輕輕晃動培養(yǎng)板，混合均勻后置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)6 h后換成完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞進行后續(xù)實驗。

1.4real-time PCR檢測mRNA表達 收集轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的各組HT-29細(xì)胞，用試劑盒提取總RNA，測定濃度和純度，保存于-80℃。然后按照RT-PCR試劑盒說明書合成cDNA，反應(yīng)程序為16℃ 30 min、42℃ 45 min、72℃ 5 min；4℃放置10 min，合成的cDNA測定濃度和純度后置于-80℃保存。取cDNA按照 real-time PCR的說明書進行反應(yīng)，反應(yīng)程序為：95℃ 6 min；95℃ 45 s、58℃ 40 s、72℃ 45 s，35個循環(huán)；72℃ 5 min。運用IQ5TM real-time PCR Detection System(Bio-Rad)進行數(shù)據(jù)分析。

1.5MTT實驗測定細(xì)胞活性 將轉(zhuǎn)染后的各組HT-29細(xì)胞進行收集，Trypsin消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度至3×103個/孔接種于96孔板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在24、48、72 h 3個時間點時進行 MTT 實驗，每孔加入 20 μl(5 mg/ml)MTT，置培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清培養(yǎng)液，每孔加入150 μl DMSO溶解結(jié)晶，室溫振蕩5 min，酶標(biāo)儀測定OD 490 nm 處的吸光度(A)值。

1.6Transwell實驗測定細(xì)胞遷移和侵襲 遷移實驗：轉(zhuǎn)染后各組HT-29細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，收集細(xì)胞加入含1%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)12～24 h，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，加入含10 g/L BSA的無血清RPMI1640培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個/ml。Transwell下層培養(yǎng)孔加入500 μl 10%FBS培養(yǎng)基作為遷移趨化物，取100 μl細(xì)胞加入Transwell上層小室，再將上層小室放入下層培養(yǎng)孔中，置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，取出用棉簽拭去基質(zhì)膠和上層小室的細(xì)胞，甲醛固定后結(jié)晶紫染色，顯微鏡觀察計數(shù)下層細(xì)胞，每個樣本計數(shù)10個視野，取平均值。

侵襲實驗：將Matrigel從-20℃取出置于4℃冰箱融化，以4℃無血清培養(yǎng)基1∶3比例稀釋Matrigel，加入上層Transwell小室，37℃ 3 h烘干，以下步驟同遷移實驗，上層小室加入100 μl細(xì)胞，下層加入500 μl 10%FBS培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，甲醛固定細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，計數(shù)。

1.7雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證PCGEM1轉(zhuǎn)錄活性 將HT-29細(xì)胞轉(zhuǎn)染后進行胰蛋白酶消化，計數(shù)，以2×104個細(xì)胞/孔接種于24孔板中,置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察若細(xì)胞融為一層，則按照Lipofectamine 2000說明書進行轉(zhuǎn)染，分別構(gòu)建PCGEM1野生型(WT-PCGEM1)和突變型(MUT-PCGEM1)雙熒光素酶報告載體，分別共轉(zhuǎn)染miR-NC或miR-433-3p，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，加入配制好的裂解緩沖液，室溫靜置裂解20 min，離心收集上清，-20℃保存或直接檢測。檢測熒光素酶活性，加入熒光素酶底物，發(fā)光儀檢測上清中熒光素酶活性。以海腎熒光素酶活性為內(nèi)參照，計算相對螢火蟲熒光素酶活性。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1PCGEM1和miR-433-3p在HT-29細(xì)胞和NCM460細(xì)胞中的表達 qRT-PCR結(jié)果表明，與正常對照NCM460細(xì)胞相比，結(jié)直腸癌細(xì)胞HT-29中PCGEM1表達量顯著升高(P<0.05)，miR-433-3p表達顯著下降(P<0.05)，見表1。

表1 PCGEM1和miR-433-3p在HT-29細(xì)胞和NCM460細(xì)胞中的表達

2.2抑制PCGEM1表達可抑制結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞增殖 qRT-PCR結(jié)果表明，與si-NC組相比，si-PCGEM1組PCGEM1表達顯著下降(P<0.05)。MTT實驗結(jié)果表明，與si-NC組相比，si-PCGEM1組細(xì)胞活性(OD 490 nm)在48、72 h顯著下降(P<0.05)，見表2。

表2 抑制PCGEM1表達對結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞增殖的影響

2.3抑制PCGEM1表達可抑制結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞遷移、侵襲的影響 Transwell實驗結(jié)果顯示，與si-NC組相比，si-PCGEM1組遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)顯著下降(P<0.05)，見圖1，表3。

圖1 抑制PCGEM1表達對結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞遷移、侵襲的影響(結(jié)晶紫染色，×200)

表3 抑制PCGEM1表達對結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞遷移、襲的影響個)

2.4過表達miR-433-3p可抑制結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞增殖、遷移、侵襲 qRT-PCR結(jié)果表明，與miR-NC組相比，miR-433-3p組miR-433-3p表達量顯著上升(P<0.05)。MTT實驗和Transwell實驗結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，miR-433-3p組HT-29細(xì)胞活性在48、72 h時顯著降低(P<0.05)，遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)顯著下降(P<0.05)，見表4。

表4 過表達miR-433-3p對結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響

2.5PCGEM1負(fù)向調(diào)控miR-433-3p的表達 Targetscan軟件預(yù)測結(jié)果顯示，PCGEM1的序列中含有與miR-433-3p互補的核苷酸序列，見圖2。雙熒光素酶報告系統(tǒng)結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，miR-433-3p組WT-PCGEM1的螢火蟲熒光素酶相對活性顯著下降(P<0.05)；而MUT-PCGEM1沒有明顯變化(P>0.05)，見表5。qRT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與si-NC組(0.58±0.06)相比，si-PCGEM1組miR-433-3p表達量(1.17±0.12)顯著上升(P<0.05)；與pcDNA組(0.63±0.06)相比，pcDNA-PCGEM1組miR-433-3p表達量(0.32±0.03)顯著下降(P<0.05)。

圖2 PCGEM1序列中含有與miR-433-3p互補的核苷酸序列

表5 雙熒光素酶報告實驗

2.6抑制miR-433-3p表達逆轉(zhuǎn)了下調(diào)PCGEM1表達對HT-29細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的作用 MTT結(jié)果顯示，在48 h和72 h時，與si-NC組相比，si-PCGEM1組細(xì)胞活性顯著下降(P<0.05)；與si-PCGEM1+anti-miR-NC相比，si-PCGEM1+anti-miR-433-3p組細(xì)胞活性顯著上升(P<0.05)。Transwell實驗結(jié)果顯示，與si-NC組相比，si-PCGEM1組遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)顯著下降(P<0.05)；與si-PCGEM1+anti-miR-NC組相比，si-PCGEM1+anti-miR-433-3p組遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)顯著上升(P<0.05)。見表6。

表6 抑制miR-433-3p表達逆轉(zhuǎn)了下調(diào)PCGEM1表達對HT-29細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的作用

3 討 論

隨著經(jīng)濟條件的提升，人們的飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致結(jié)直腸癌發(fā)病率不斷上升〔18〕，而結(jié)直腸癌患者術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致預(yù)后不良和死亡率上升的主要原因。大量研究表明，lncRNA和miRNA在結(jié)直腸癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移起重要作用〔19,20〕。

lncRNA PCGEM1在多種癌組織中出現(xiàn)異常表達，與癌細(xì)胞的侵襲和遷移有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA PCGEM1在前列腺癌組織中過量表達，與前列腺癌細(xì)胞的增殖和遷移密切相關(guān)〔6，8,10〕。Shuo等〔7〕研究表明，PCGEM1可能通過上調(diào)RHoA的表達誘導(dǎo)上皮性卵巢癌腫瘤發(fā)生和發(fā)展。徐岷等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)，PCGEM1在胰腺癌組織中表達水平高于癌旁組織，抑制PCGEM1表達可降低癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。但尚未有研究闡述PCGEM1是否影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和遷移。本研究結(jié)果提示，抑制PCGEM1表達可以抑制HT-29細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的能力。且驗證了PCGEM1在多種癌細(xì)胞和組織中表達量被顯著上調(diào)，促進癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移的結(jié)論。

miR433與多種癌癥的增殖、遷移和侵襲有關(guān)。Xu等〔14〕研究表明miR-433在膀胱癌中被下調(diào)，過表達miR-433則會通過調(diào)控下游靶基因c-Met 和CREB1抑制EMT通路，從而抑制癌細(xì)胞的侵襲和遷移。Yang等〔15〕發(fā)現(xiàn)，miR-433通過抑制CREB13'-UTR 活性和蛋白表達抑制肝癌細(xì)胞的遷移。Shi等〔16〕研究發(fā)現(xiàn)，miR-433-3p通過抑制GRB2基因表達抑制食管鱗狀細(xì)胞癌ESCC的增殖、遷移和侵襲。Sun等〔17〕發(fā)現(xiàn)，miR-433-3p通過靶向調(diào)控CREB抑制人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時提高人膠質(zhì)瘤對替莫唑胺的化學(xué)敏感性。但miR-433-3p在結(jié)直腸癌中尚未被研究，本研究首次闡述了miR-433-3p對結(jié)直腸癌的作用，過表達miR-433-3p可抑制結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，抑制miR-433-3p表達逆轉(zhuǎn)了下調(diào)PCGEM1表達對HT-29細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的作用，同樣說明miR-433-3p在多種癌細(xì)胞的侵襲遷移中起重要調(diào)節(jié)作用。

綜上，PCGEM1在HT-29細(xì)胞中參與負(fù)向調(diào)控miR-433-3p的表達，PCGEM1通過下調(diào)miR-433-3p表達促進結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。PCGEM1可作為結(jié)直腸癌分子靶向治療新的研究方向。