秦瑞麗 董志強 張昕 樊勤梅 趙欣

(內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 1心功能科，內(nèi)蒙古 包頭 014010；2藥劑科)

慢性心力衰竭(心衰)后期與惡性腫瘤相似，常會伴有機體消耗，表現(xiàn)為厭食、消瘦、貧血等，與葡萄糖、蛋白質(zhì)代謝異常和脂肪組織分解、肌肉萎縮等相關(guān)，隨著肌肉、脂肪組織和骨組織減少到一定程度就會出現(xiàn)以體重減輕、機體構(gòu)成改變?yōu)樘卣鞯男乃翰≠|(zhì)(CC)〔1〕。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，CHF患者中有10%～16%合并有惡病質(zhì)的發(fā)生，其中50%患者在18個月內(nèi)死亡，CC是心衰患者死亡的一個獨立危險因素〔2〕。然而，其發(fā)生機制目前尚未明確，臨床上所能采取的應(yīng)對措施也非常有限。異丙腎上腺素(ISO)是常用的制作擴張型心肌病大鼠模型的藥物，其主要的藥理作用是通過激動心肌細胞上的β1受體，引起心肌細胞的強烈收縮造成心肌細胞缺血、損傷和斷裂〔3〕。本研究擬探索制作心衰惡病質(zhì)特征大鼠模型的ISO劑量。

1 材料與方法

1.1DCM大鼠模型的建立 選用清潔級10～12周齡雄性SD大鼠100只，體重280～300 g，由內(nèi)蒙古大學(xué)實驗動物中心提供。按照內(nèi)蒙古實驗動物飼養(yǎng)管理標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行，北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供的飼料為標(biāo)準(zhǔn)柱狀飼料。動物分籠飼養(yǎng)于有空氣過濾系統(tǒng)的安靜環(huán)境中，室溫維持在20～25℃，大鼠正常進食與活動。ISO由大連美侖生物有限公司提供。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，隨機抽取90只腹股溝皮下注射不同劑量的ISO制作心衰模型，分別為低劑量組〔120 mg/(kg·d)〕、中等劑量組〔180 mg/(kg·d)〕及高劑量組〔250 mg/(kg·d)〕。其余10只大鼠注射等體積9 g/(L·d)生理鹽水作為對照組。注射ISO的方法：用0.9%生理鹽水溶解粉劑ISO，終濃度為20 mg/ml，按3個劑量級，隔日1次，共2次，為了避免皮膚壞死，第2次換作另一側(cè)進行注射，所有大鼠用藥后正常進食和活動，飼養(yǎng)4 w后根據(jù)體重變化及超聲心動圖結(jié)果將ISO組分為CC組(較對照組體重下降>6%)與心衰非惡病質(zhì)組(其余大鼠)。

1.2一般情況觀察 注射ISO后觀察大鼠的皮毛顏色、進食、活動等，記錄死亡情況。

1.3模型成功的評價方法 (1)超聲心動圖檢查：注射藥物后清潔環(huán)境下飼養(yǎng)大鼠4 w后行超聲心動圖檢查，10%的水合氯醛腹腔注射進行麻醉，取仰臥并固定四肢和頭部于干凈木板上。剪除胸部體毛，用S4-2高頻探頭飛利浦HD11XE彩色超聲診斷儀，在二維超聲引導(dǎo)下，選取左室乳頭肌短軸切面進行檢查。測量指標(biāo)包括左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)及短軸縮短率(FS)，每只測5個心動周期，取平均值。(2)組織病理學(xué)檢查：取大鼠心肌組織，用冰生理鹽水沖洗2遍，快速置于固定液(即95%乙醇：40%甲醛原液=9∶1的混合固定液)中固定后常規(guī)石蠟包埋，行Masson染色，光鏡下觀察心肌細胞組織學(xué)形態(tài)變化。(3)體重變化:所有大鼠注射藥物前及注射后4 w分別記錄體重。

1.4生化營養(yǎng)指標(biāo)檢測 注射藥物4 w后，大鼠禁食12 h，取腹主動脈血分離血清，全自動生化分析儀檢測血清中總白蛋白、三酰甘油、膽固醇、血糖。

1.5標(biāo)本的收集和處理 (1)采集血樣：大鼠腹腔注射10%的水合氯醛麻醉，取仰臥位，固定四肢和頭部于手術(shù)臺上，腹部去毛，于手術(shù)部位用5%乙醇消毒，從劍突下腹正中線切口，分層打開腹腔。在腎動脈分支以下鈍性游離腹主動脈，連接采血管，采血量>5 ml，所采血于常溫下保存30 min后，4℃，3 000 r/min離心5 min，分離血清，將其分成2小管，置于-20℃冰箱下保存，用于生化營養(yǎng)指標(biāo)檢測及酶聯(lián)免疫吸附試驗測定胰島素、胰島素樣生長因子濃度。(2)心肌標(biāo)本處理：取大鼠心肌組織，生理鹽水沖洗2遍，去除表面水分及結(jié)締組織，立刻置于固定液中，室溫保存24 h后石蠟包埋，用于Masson染色。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS16.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析、q檢驗、χ2檢驗及Fisher確切概率法。

2 結(jié) 果

2.1動物的一般情況 注射ISO藥物后90只大鼠死亡19只，大部分于注射藥物12 h內(nèi)死亡，死亡率為 21.1%。其中高劑量組死亡10只，死亡率33.3%；中等劑量組死亡6只，死亡率20.0%；低劑量組死亡3只，死亡率10.0%。3組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。而對照組無死亡。與對照組相比，注射ISO大鼠大部分出現(xiàn)口唇發(fā)紺，口中出現(xiàn)血性分泌物，皮毛發(fā)黃無光澤，活動量明顯減少，體重?zé)o明顯增加。

2.2超聲心動圖結(jié)果 與對照組相比，ISO組LVEDD、LVESD顯著增大(P<0.05)，LVEF顯著降低(P<0.05)，見表1、圖1。進一步比較，高劑量組、中等劑量組的 LVEDD、LVESD與ISO組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；低劑量組 LVEDD、LVESD明顯小于ISO組(P<0.05)；高劑量組、中等劑量組的LVEF明顯低于ISO組(P<0.05)，但低劑量組與ISO組無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

表1 對照組與ISO組心功能比較

圖1 對照組與ISO組超聲心動圖

2.3體重變化 注射藥物前ISO組與對照組體重?zé)o統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，注射藥物4 w后CC組體重顯著低于心衰非惡病質(zhì)組和對照組(P<0.05)，心衰非惡病質(zhì)組低于對照組(P<0.05)，見表2。

2.4生化營養(yǎng)指標(biāo)變化 總蛋白在CC組顯著低于對照組(P<0.05)，與心衰非惡病質(zhì)組比較無顯著差異(P>0.05)，但心衰非惡病質(zhì)組顯著低于對照組(P<0.05)。三酰甘油、膽固醇在CC組顯著高于非惡病質(zhì)組和對照組(P<0.05)，但心衰非惡病質(zhì)組與對照組比較無顯著差異(P>0.05)。血糖在CC組顯著低于非惡病質(zhì)組和對照組(P<0.05)，但心衰非惡病質(zhì)組與對照組比較無顯著差異(P>0.05)，見表2。

表2 各組體重及生化營養(yǎng)指標(biāo)比較

2.5心肌組織病理學(xué)觀察 ISO組心肌纖維排列紊亂，心肌細胞肥大且可見壞死消失，被大量纖維組織(綠色染色處)所取代，見圖2。

圖2 各組心肌組織(Masson染色，×100)

3 討 論

CC是心衰后期出現(xiàn)的營養(yǎng)不良綜合征，要想制作CC模型，首先需制作大鼠心衰模型。目前在實驗研究中，大鼠模型常用的制作方法有藥物注射法(ISO、阿霉素等)、結(jié)扎冠脈法、心臟超負荷法等〔4〕。大量的研究表明，通過小劑量長時間注射ISO建立心衰模型成功率高，大鼠死亡率低且操作簡單易行，但時間較長，重復(fù)性較差〔5〕；也有研究用腹股溝皮下注射250 mg/(kg·d)ISO連續(xù)2 d制作心衰模型，但其死亡率較高并出現(xiàn)注射部位無菌性壞死〔6〕。本實驗參考之前的研究探索3個級別ISO劑量制作模型的成功率，發(fā)現(xiàn)180 mg/(kg·d)、隔日1次、共2次注射ISO是最佳的劑量選擇，該劑量組大鼠模型死亡率較低，注射部位未見明顯無菌性壞死，并且超聲心動圖及心肌組織病理學(xué)結(jié)果均提示心衰模型建立成功，造模時間短，重復(fù)性好。

根據(jù)CC診斷標(biāo)準(zhǔn)，在心衰模型建立成功的前提下，其體重下降超過6%者才符合〔7〕。實驗中所選大鼠在注射藥物前體重相當(dāng)，注射ISO 4 w后發(fā)現(xiàn)部分大鼠體重較對照組下降超過6%，說明心衰后期部分大鼠合并有惡病質(zhì)的發(fā)生。類似的對癌性惡病質(zhì)的研究也提到，只將體重下降程度作為判斷大鼠是否進入惡病質(zhì)狀態(tài)不太準(zhǔn)確，因此為了證實實驗的分組是否合理，CC組是否進入惡病質(zhì)狀態(tài)，本研究還進行了生化營養(yǎng)指標(biāo)測定，結(jié)果可以看出大鼠存在顯著的營養(yǎng)不良和蛋白質(zhì)、糖類、脂類代謝紊亂，低血糖可能與惡病質(zhì)狀態(tài)下肝臟糖原儲備減少有關(guān)，而外周血膽固醇增加與脂肪組織分解增加相關(guān)〔8〕。研究證實心衰患者三酰甘油、膽固醇總量未發(fā)生明顯改變，而亞油酸含量明顯增高，花生四烯酸明顯降低，即膽固醇酯中多不飽和脂肪酸發(fā)生了改變，導(dǎo)致其改善血管內(nèi)皮功能及血管順應(yīng)性的功能下降，說明心衰患者僅存在脂肪酸代謝紊亂而尚未出現(xiàn)顯著的脂類代謝紊亂〔9〕。相關(guān)的臨床研究報道也提出膽固醇與心衰的發(fā)生相關(guān)性不大，而高密度脂蛋白、低密度脂蛋白與心衰的發(fā)生關(guān)系密切〔10〕。因此CC組與心衰非惡病質(zhì)組間有明顯差別，前者體內(nèi)存在顯著的脂類代謝紊亂。本研究可以看出心衰時總蛋白下降，而CC時總蛋白、血糖均顯著降低，說明兩者均存在營養(yǎng)不良，只是程度不同而已，兩者血糖差異有統(tǒng)計學(xué)意義，可能與CC體內(nèi)胰島素水平異常升高有關(guān)。

總之，CC組與非惡病質(zhì)組在三大物質(zhì)代謝方面有顯著差異，前者存在顯著的營養(yǎng)不良和蛋白質(zhì)、糖類、脂類代謝紊亂，明顯處于惡病質(zhì)狀態(tài)，說明本研究的分組符合標(biāo)準(zhǔn)，證實了CC大鼠模型建立成功。