王若汗 李慶杰 成光宇 張鳳清

(1長春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130012；2長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院)

胡桃醌(Juglone，Nuein)又名5-羥基-1,4-萘醌，是從胡桃楸新鮮根皮、枝皮、青果皮中分離出來的羥基萘醌類化合物〔1〕，具有抗菌、降血糖、抗腫瘤等生物活性〔2〕。Zhang等〔3〕通過將不同濃度的胡桃醌與宮頸癌細(xì)胞孵育，溴化四氮唑藍(lán)(MTT)法檢測胡桃醌對宮頸癌細(xì)胞增殖的抑制作用。通過觀測細(xì)胞凋亡的發(fā)生，Western印跡法檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明，胡桃醌對人宮頸癌細(xì)胞的生長有抑制作用，且呈劑量依賴性。Kiran等〔4〕通過流式細(xì)胞術(shù)分析凋亡/壞死誘導(dǎo)，觀察到細(xì)胞存活率與胡桃醌的濃度依賴性降低，而乳酸脫氫酶水平相應(yīng)升高。表明胡桃醌有可能在黑色素瘤腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞遺傳學(xué)損傷。Fang等〔5〕通過MTT法分析胡桃醌對SKOV3細(xì)胞增殖的抑制作用，研究了用胡桃醌處理的SKOV3細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡，通過蛋白質(zhì)印跡分析法檢測細(xì)胞周期蛋白D1、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)，Bax、細(xì)胞色素(Cyt)c、caspase-9和caspase-3的蛋白表達(dá)水平。表明胡桃醌可以誘導(dǎo)人卵巢癌細(xì)胞(SKOV3)細(xì)胞凋亡，并伴有caspase-9和caspase-3活化，降低了Bcl-2水平并增加Bax和Cytc水平，并且能夠充分抑制侵襲，同時明顯降低基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2的表達(dá)。本研究分析胡桃醌對人胃癌細(xì)胞SGC-7901凋亡相關(guān)基因β-蛋白表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1藥品 胡桃醌單體(成都普菲德生物技術(shù)有限公司)，純度99.1%。

1.2主要試劑 胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；胰酶、RPMI1640培養(yǎng)基(Invitrogen公司)；細(xì)胞計數(shù)試劑盒8(廣州市碩恒生物科技有限公司)；BeyoECL plus(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；MTT(Sigma公司)。

1.3細(xì)胞株 宮頸癌細(xì)胞(HELA)，SGC-7901，人肝癌細(xì)胞株(Hep-2)，人肺腺癌細(xì)胞株(A549)，乳腺癌細(xì)胞株(MCF7)，人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y-P9)均由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)教研室提供。

1.4主要儀器 INFINITE M200酶標(biāo)儀(瑞士TECAN)，IX71倒置熒光顯微鏡(日本OLYMPUS)，MILI Q超純水器(美國MILLIPORE)，二氧化碳培養(yǎng)箱(美國 THERMO)，LD5-2B離心機(jī)(北京雷勃爾離心機(jī)有限公司)，BSA224S電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)，JB-3A恒溫磁力攪拌器(雷茲互感器(上海)有限公司)，LDZX-30KBS型蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械有限公司)；高效液相色譜儀LC-20AT(日本島津)，KQ5200DB型超聲機(jī)(江蘇省昆山市超聲儀器有限公司)，BS110S型電子分析天平(北京塞多利斯天平有限公司)，T6新世紀(jì)紫外可見分光光度儀(北京普析通用)，EYELASB-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)。

1.5細(xì)胞培養(yǎng) 各細(xì)胞株培養(yǎng)于含10% 胎牛血清(FBS)的H-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，HELA、SGC-7901、MCF-7、Hep-2、A549、SH-SY5Y-P9細(xì)胞株，37℃，飽和濕度，5% CO2培養(yǎng)。每周更換培養(yǎng)基3次，待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時進(jìn)行細(xì)胞種板。棄去培養(yǎng)液，加入磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次后，加入0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞。

1.6制備胡桃醌樣品溶液 稱取10 mg胡桃醌樣品，加入2 ml PBS，超聲機(jī)設(shè)置功率100 W，頻率50 kHz，超聲處理10 min，使用0.22 μm濾膜過濾除菌，制成5 mg/ml樣品儲備液，放入冰箱冷藏保存。

1.7CCK8法篩選最適敏感菌株 取對數(shù)生長期的細(xì)胞在96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，每孔加入100 μl，濃度為5×103，培養(yǎng)條件：37℃飽和濕度，5% CO2。培養(yǎng)24 h，空白孔和陰性對照孔加入培養(yǎng)液100 μl，樣品孔加入樣品溶液100 μl使終濃度為0.000 0、0.062 5、0.125 0、0.250 0、0.500 0、1.000 0、2.000 0、4.000 0 μg/ml每個濃度設(shè)3個復(fù)孔。置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，加入10 μl CCK-8試劑，以只加100 μl完全培養(yǎng)液和CCK-8試劑作為空白對照。培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀450 nm測定各孔吸收值A(chǔ)。 細(xì)胞存活率=(A樣品-A空白)/(A對照-A空白)×100%。

1.8高通量測序與生物信息學(xué)分析 按試劑盒說明提取總RNA，通過Illumina高通量測序獲取胡桃醌處理的SGC-7901和對照組細(xì)胞基因表達(dá)數(shù)據(jù)并通過R語言“DESeq2”包實現(xiàn)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，篩選差異表達(dá)基因的閾值設(shè)置為：|logFC|>1且P<0.05。通過R語言“ggfortify”包進(jìn)行主成分分析，R語言“clusterProfiler”包用于KEGG信號通路富集分析。

1.9Western印跡方法 采用Novagen公司的Cytobnster提取SGC-7901總蛋白，提取蛋白經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離膠和5%濃縮膠分離，Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)濕式轉(zhuǎn)膜裝置設(shè)置轉(zhuǎn)膜電流300 mA,轉(zhuǎn)膜時間40 min，轉(zhuǎn)膜槽放置于冰浴中轉(zhuǎn)膜，將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜。用含5%脫脂奶粉1×Tween-20 Tris鹽酸緩沖液(TBST)浸泡硝酸纖維素膜，室溫封閉搖2 h。將封閉過的膜放于一抗稀釋液中，4℃過夜。第2天吸棄一抗稀釋液，用1×TBST洗3次，每次5 min。稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗。加入稀釋好的二抗，室溫旋轉(zhuǎn)孵育1 h。吸棄二抗稀釋液后，0.1% TBST室溫下洗膜3次，每次5 min;使用BeyoECL進(jìn)行染色。

1.10實時定聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測p53 mRNA表達(dá)水平 按試劑盒說明提取總RNA，GAPDH，p53的引物及擴(kuò)增片段長度見表1。RT-PCR按說明書進(jìn)行，擴(kuò)增條件:94℃ 5 min，94℃ 30 s，56℃ 45 s，72℃ 90 s，30個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物用含0.5 mg/L溴化乙錠的15 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行，最后用凝膠成像系統(tǒng)Quanity one軟件分析結(jié)果，以目的基因與GAPDH條帶的相對含量比值表示。

表1 PCR引物序列和產(chǎn)物長度

1.11統(tǒng)計學(xué)方法 采用Graphpad軟件進(jìn)行Anova檢驗。

2 結(jié) 果

2.1胡桃醌對SGC-7901存活率的影響 胡桃醌對6種腫瘤細(xì)胞都有一定的抑制作用，其中對人SGC-7901半數(shù)抑制濃度為0.287 3 μg/ml，是6種腫瘤細(xì)胞中最敏感細(xì)胞，以SGC-7901進(jìn)行差異基因的篩選。見圖1。胡桃醌對SGC-7901活性抑制效果最為明顯，且隨著胡桃醌濃度的升高對細(xì)胞活性的抑制效果增強(qiáng)(濃度從小至大，P53/GAPDH值分別為(90.43±2.16)%、(69.86±1.49)%、(55.14±1.89)%、(45.37±1.23)%、(39.55±1.35)%、(36.26±1.79)%、(34.25±1.02)%，細(xì)胞存活率明顯下降時濃度為0.125 0 μg/ml，且在胡桃醌濃度達(dá)到0.250 0 μg/ml時，細(xì)胞存活率接近50%，且組間差異顯著(P<0.05)，因此選擇0.125 0、0.250 0、0.500 0、1.000 0 μg/ml濃度進(jìn)行后期實驗。

圖1 不同濃度胡桃醌對6種細(xì)胞存活率的影響

2.2高通量測序差異基因篩選及生物信息學(xué)分析 通過高通量測序，獲得了胡桃醌處理的SGC-7901與對照組細(xì)胞中的31 695個基因的表達(dá)數(shù)據(jù)。通過主成分分析可知，實驗組與對照組基因表達(dá)差異較大。見圖2。然后基于|logFC|>1且P<0.05的閾值，最終篩選得到4 248個差異表達(dá)的基因，其中2 364個差異基因顯著上調(diào)，1 884個差異基因顯著下調(diào)。通過火山圖可視化該數(shù)據(jù)，進(jìn)一步KEGG信號通路富集分析這些差異基因主要富集在酒精中毒信號通路、Hippo信號通路、Apelin信號通路及p53信號通路等。見圖3、4。

圖2 主成分分析

圖3 差異表達(dá)基因火山圖

圖4 KEGG信號通路富集分析

2.3凋亡相關(guān)基因蛋白表達(dá)水平檢測結(jié)果 由Western印跡結(jié)果可知，與對照組〔(98.57±3.98)%〕相比，SGC-7901凋亡相關(guān)基因p53蛋白表達(dá)水平在胡桃醌作用后顯著上調(diào)，且與胡桃醌濃度呈劑量依賴關(guān)系，其表達(dá)量隨著胡桃醌濃度的升高而升高(濃度從小至大，P53/GAPPH依次為〔(119.61±5.96)%、(131.75±5.21)%、(148.29±5.15)%、(156.14±4.37)%〕，組間差異顯著(P<0.05)。見圖5。

圖5 胡桃醌對SGC-7901 p53基因影響的Western印跡結(jié)果

2.4胡桃醌對SGC-7901 p53 mRNA表達(dá)的影響 經(jīng)RT-PCR方法檢測，不同濃度胡桃醌誘導(dǎo)SGC-7901凋亡后p53基因mRNA表達(dá)水平較對照組(0.41±0.02)明顯增強(qiáng)，且與胡桃醌濃度呈劑量依賴關(guān)系，其表達(dá)量隨著胡桃醌濃度的升高而升高〔濃度從小至大，P53 mRNA/GAPDH分別為(0.51±0.02)、(0.79±0.02)、(0.83±0.02)、(0.87±0.02)，組間差異顯著(P<0.05)〕。

3 討 論

胃癌為人類常見的惡性腫瘤之一，近年來，隨著人們飲食結(jié)構(gòu)的變化，胃癌的發(fā)病率也大大提升〔6〕。胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過程，主要包括腫瘤細(xì)胞遷徙、黏附，細(xì)胞外基質(zhì)降解，腫瘤血管形成等〔7〕據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，男性主要惡性腫瘤有肺癌、肝癌、胃癌；女性主要惡性腫瘤有肺癌、胃癌、肝癌。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)調(diào)查顯示，癌癥死亡的最常見原因是肺癌(160萬例死亡)，肝癌(74.5萬例死亡)和胃癌(72.3萬例死亡)〔8〕。雖然說過去的100多年中胃癌不是致死率最高的癌癥，但其死亡率仍居于世界第二位〔9〕。

本研究基于胡桃醌處理的胃癌細(xì)胞，利用二代測序的技術(shù)，篩選胡桃醌處理的SGC-7901和對照組細(xì)胞的差異表達(dá)基因。差異程度最高的前5個上調(diào)基因與前5個下調(diào)基因被認(rèn)為在胡桃醌處理后的胃癌細(xì)胞反應(yīng)中可能發(fā)揮關(guān)鍵作用，顯著上調(diào)：TRIM39-RPP21、SPATC1、PCDH17、MMP2、ANGPT1；顯著下調(diào)：SPI1、GAGE12J、TNFSF12-TNFSF13、CSF3R、AC005154.6。此外，胃癌細(xì)胞對胡桃醌處理的反應(yīng)與p53信號通路顯著相關(guān)。因此，進(jìn)一步探究p53信號通路中的分子在該過程中的變化與作用機(jī)制對胡桃醌治療胃癌的臨床實踐有很大的意義。綜上，胡桃醌導(dǎo)致SGC-7901凋亡的機(jī)制可能是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡水平而發(fā)揮的，與調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因p53表達(dá)相關(guān)，該研究為臨床上利用胡桃醌靶向抑制腫瘤細(xì)胞生長的方法提供了一定的科學(xué)依據(jù)。