熊駿 廖鵬 吳映霖 游宇 黃媛華 黃國(guó)棟 余淑嬌

(1南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江西 南昌 330006；南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院 2中西醫(yī)結(jié)合科；3麻醉科；4消化科；5湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬衡陽(yáng)醫(yī)院肛腸科；6南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科)

潰瘍性結(jié)腸炎多表現(xiàn)為反復(fù)出現(xiàn)的腹痛、腹瀉、黏液膿血便，是一種慢性非特異性炎癥性疾病。在發(fā)病時(shí)多伴有部分腸外癥狀和全身癥狀。其特異性致病因素及發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，目前普遍認(rèn)為，炎癥因子和抗炎因子的失衡導(dǎo)致潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生。免疫異常是本病的重要因素，可能涉及多種細(xì)胞因子。當(dāng)免疫功能正常時(shí)，許多細(xì)胞因子的分泌和活性處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)〔1～5〕。研究認(rèn)為潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病時(shí)，機(jī)體內(nèi)各種細(xì)胞因子之間相互作用，促炎與抗炎細(xì)胞因子失衡，導(dǎo)致黏膜損傷〔6～8〕。研究中發(fā)現(xiàn)，白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-4和IL-6與潰瘍性結(jié)腸炎密切相關(guān)，同時(shí)這些細(xì)胞因子表達(dá)水平與核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κВ的激活密切相關(guān)〔9，10〕。本研究旨在探討姜黃素殼聚糖微球?qū)冃越Y(jié)腸炎的治療作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性BALB/c大鼠120只，體重180～210 g，由長(zhǎng)沙市開福區(qū)東創(chuàng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供(SCXK湘2009-0012)，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，喂養(yǎng)水為純凈水。

1.2藥物與試劑 5%葡聚糖硫酸鈉(DSS)購(gòu)自北京諾特萊斯生物科技有限公司；大鼠抗人NF-κВ單克隆抗體、鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法(SP)二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒(PV-6002)購(gòu)自北京中杉金橋生物工程有限公司；IL-1β、IL-4、IL-6購(gòu)自欣博康生物科技有限公司；美沙拉嗪腸溶片購(gòu)自佳木斯鹿靈制藥有限責(zé)任公司(生產(chǎn)批號(hào)：H19980148)；姜黃素購(gòu)自西安應(yīng)化生物技術(shù)有限公司(生產(chǎn)批號(hào)：20100220)。

1.3造模方法 大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型采用5%DSS建立〔11〕：隨機(jī)取BALB/c大鼠100只，自由飲用5%DSS水溶液，同時(shí)分別灌胃給予干預(yù)藥物，0.2 ml/(10 g·體重)，1次/d，連續(xù)7 d后再飲用不含DSS的蒸餾水14 d。

1.4動(dòng)物分組及藥物治療 將未經(jīng)任何處理的20只大鼠設(shè)為空白對(duì)照組，正常飲水、飲食。將100只潰瘍性結(jié)腸炎大鼠隨機(jī)分為5組各20只。模型組：5%DSS自由飲水，正常飲食；陽(yáng)性對(duì)照組：5%DSS自由飲水+含5 g/L柳氮磺胺吡啶的飼料喂養(yǎng)；殼聚糖微球組：5%DSS自由飲水+含15 g/L殼聚糖微球的飼料喂養(yǎng)；姜黃素組：5%DSS自由飲水+含20 g/L姜黃素的飼料喂養(yǎng)；姜黃素殼聚糖微球組：5%DSS自由飲水+含20 g/L姜黃素殼聚糖微球的飼料喂養(yǎng)。所有大鼠給藥4 w。

1.5標(biāo)本采集 給藥4 w后股靜脈采血2 ml，取肛門上8 cm處的結(jié)腸組織用于檢測(cè)，治療結(jié)束后采用頸椎脫臼法處死。

1.6病理及免疫組化檢測(cè) 組織學(xué)損傷評(píng)分：參考Dieleman等〔10〕制定的標(biāo)準(zhǔn)，以結(jié)腸黏膜損傷點(diǎn)的長(zhǎng)度作為結(jié)腸損傷分?jǐn)?shù)方法。1分：≤0.5 mm；2分：>0.5 mm且≤1.0 mm；3分：>1.0 mm且≤2.0 mm；以此類推，損傷點(diǎn)寬度>2.0 mm時(shí)，分?jǐn)?shù)加倍。疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分：參照Murano等〔12〕建立評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，每日監(jiān)測(cè)體重、大便性狀及便血情況(采用聯(lián)苯胺法測(cè)定)。疾病活動(dòng)指數(shù)(DIA)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：體重?zé)o下降，糞便性狀正常，便檢隱血(-)計(jì)0分；體重下降>0且<5%，糞便性狀半稀，便檢隱血(+)計(jì)1分；體重下降≥5%且<10%，糞便性狀半稀，便檢隱血(+)計(jì)2分；體重下降≥10%且<15%，糞便性狀半稀，便檢隱血(+)計(jì)3分；體重下降≥15%，糞便性狀稀便，肉眼血便計(jì)4分。病理學(xué)檢測(cè)：剪取病變最明顯處結(jié)腸組織，常規(guī)病理切片并攝像，并對(duì)結(jié)腸標(biāo)本行蘇木素-伊紅(HE)染色。免疫組化檢測(cè)：剪取距離肛門8～10 cm處的大鼠結(jié)腸組織用冷生理鹽水反復(fù)沖洗干凈，剪取肉眼所能看見的病變最明顯的一段潰瘍結(jié)腸黏膜，浸入4℃預(yù)冷的2.5%戊二醛進(jìn)行前固定，再經(jīng)1%鋨酸后固定，制備4 μm厚石蠟連續(xù)切片，待免疫組化檢測(cè)腸黏膜NF-κB表達(dá)，具體按MaxVisionTM試劑盒說明書進(jìn)行。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清IL-1β、IL-6和IL-4的表達(dá)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1病理結(jié)果 模型組結(jié)腸黏膜遭嚴(yán)重破壞，部分有缺損，黏膜內(nèi)腺體排列紊亂、變形。姜黃素殼聚糖微球組及姜黃素組病變較輕，黏膜較為完整?？瞻讓?duì)照組結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)規(guī)則，腺體排列整齊。見圖1。

圖1 各組結(jié)腸組織病理(HE染色，×100)

2.2各組結(jié)腸損傷評(píng)分比較 治療4 w后，模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、殼聚糖微球組、姜黃素殼聚糖微球組和姜黃素組均表現(xiàn)為潰瘍形成，模型組損傷評(píng)分最高。姜黃素殼聚糖微球組與其他組相比，結(jié)腸黏膜組織學(xué)損傷評(píng)分顯著降低(P<0.01)。治療4 w后，模型組、殼聚糖微球組、姜黃素殼聚糖微球組和姜黃素組均表現(xiàn)為不同程度體重下降、便稀、便血，模型組疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分最高；姜黃素殼聚糖微球組與其他各組比較差異顯著(P<0.01)。見表1。

表1 各組結(jié)腸損傷及疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分比較分)

2.3各組NF-κB 、IL-1β、IL-4、IL-6水平比較 經(jīng)4 w治療，姜黃素組和姜黃素殼聚糖微球組IL-4水平明顯高于模型組和陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.01)，而IL-1β、IL-6、NF-κB水平明顯低于模型組和陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.01)；姜黃素殼聚糖微球組與姜黃素組相比，血清IL-1β、IL-6、NF-κB含量明顯降低(P<0.01)，IL-4含量顯著升高(P<0.01)，見表2。

表2 治療后各組NF-κB 、IL-1β、IL-4、IL-6水平比較

3 討 論

姜黃素是從姜科植物姜黃中提取的一種酚類物質(zhì)，在傳統(tǒng)的中藥理論中具有抗炎、止痛，活血化瘀的功效，現(xiàn)代醫(yī)藥還發(fā)現(xiàn)姜黃素具有抗氧化、降血脂、抗凝、抗腫瘤及清除氧自由基等作用。研究表明，姜黃素具有抗炎癥性腸病的作用〔5～7〕。但由于姜黃素穩(wěn)定性較差，在水中不易溶解，且體內(nèi)代謝半衰期較短，故不易制備成片劑、膠囊劑或注射劑等劑型，大大限制了其臨床應(yīng)用。

藥物緩釋體系是近年來藥物研究最熱門的領(lǐng)域之一。在藥物控釋技術(shù)方面，需要藥物分子與藥物載體按照一定的物理或化學(xué)方式相結(jié)合，通過特殊的藥物制劑工藝和技術(shù)，使藥物按要求釋放以達(dá)到更好的治療效果。實(shí)現(xiàn)藥物的裝載方式主要有物理吸附、物理包封、化學(xué)耦聯(lián)〔8,9〕。物理包封過程中，載體的交聯(lián)程度是影響藥物釋放的關(guān)鍵因素之一。目前研究較多的是可降解微球和水凝膠兩種載藥方式〔10,11〕。微球是指用高分子生物材料將藥物包裹形成的直徑為幾微米到幾百微米的微小球狀實(shí)體。交聯(lián)度不同的載藥微球，藥物的釋放率有所差異，這表現(xiàn)在交聯(lián)度高的微球載體表現(xiàn)為延時(shí)緩釋，而交聯(lián)度低的表現(xiàn)為暴釋。同一種藥物裝載于不同的載體，由于載體結(jié)構(gòu)間的差異，與藥物間的作用方式的不同，會(huì)影響藥物的緩釋能力及藥物作用于病灶的功效。與此同時(shí)單純的殼聚糖微球在潰瘍性結(jié)腸炎的治療中也起到了一定的抑制炎癥反應(yīng)的作用，有相關(guān)文獻(xiàn)也表明，殼聚糖對(duì)結(jié)腸炎的改善作用可能是通過抑制 NF-κB 通路減少炎性細(xì)胞因子的釋放起作用〔13〕，因此，用殼聚糖微球制成的姜黃素殼聚糖在治療潰瘍性結(jié)腸炎方面效果更好，其作用機(jī)制可能是姜黃素殼聚糖微球通過抑制NF-κВ的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，通過抗炎作用達(dá)到減輕潰瘍性結(jié)腸炎中結(jié)腸組織損傷的效果。