王淑英 王為光 高占群 李堯 李文 侯麗然 劉月霞 趙文杰

(佳木斯大學(xué) 1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2附屬第一醫(yī)院；3海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院)

由缺血導(dǎo)致的腦血管疾病有發(fā)病率高、死亡率高、復(fù)發(fā)率高的特點，且再灌注過程中伴有腦組織進一步損傷。目前，臨床尚不能完全闡述缺血再灌注損傷的發(fā)病機制，對其還缺乏有效的治療手段。本實驗旨在通過觀察腦缺血再灌注損傷后大鼠的神經(jīng)病學(xué)行為、神經(jīng)元病理學(xué)變化、缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α表達及銀杏葉提取物(EGB)對其影響，探討EGB發(fā)揮腦組織保護作用的機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 Wistar大鼠，性別不限，體重280～380 g，被隨機分為假手術(shù)組(n=15)：分離大腦中動脈，不進行栓塞；模型組(n=15)：栓塞大腦中動脈2 h，再進行24 h灌注；EGB治療組(n=15)：栓塞大腦中動脈2 h，栓塞后2 min內(nèi)通過尾靜脈注射EGB(20 mg/kg)，再進行24 h灌注，期間共給藥3次。大鼠術(shù)前自由飲水，禁食12 h。

1.2模型制備 參考Nagasawa等〔1〕、汪家龍等〔2〕、羅勇等〔3〕報道的方法，頸內(nèi)動脈線栓法制備腦缺血模型。將大鼠用3.5%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉。固定，正中切開頸部皮膚，將右側(cè)頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)、頸內(nèi)動脈(ICA)鈍性游離。由CCA分叉處向頭端依次游離，ECA的分支用電熱燒灼器燒斷，使其主干游離。再分離ICA至顱底。將CCA和ICA用蛙心夾夾住，在ECA(近CCA分叉處)上剪一小口，將栓子沿切口插入，經(jīng)CCA分叉處并將事先放置在ECA根部的手術(shù)縫合線扎緊，防出血和栓子滑出，放開ICA上的蛙心夾，將栓子緩慢地向ICA入顱方向插入19～21 mm，稍有阻力即止，栓子頭端停留在大腦中動脈(MCA)與大腦前動脈的分叉處，固定栓子，栓塞完成。2 h后，將栓子輕拉使其頭端回到ECA內(nèi)，即開始MCA再灌注。假手術(shù)組除不插線外，其他皆同模型組。EGB治療組術(shù)后2 min內(nèi)大鼠尾靜脈注射EGB，20 mg/kg，3次/d，假手術(shù)組和模型組注射同等量的生理鹽水。每組均在再灌注24 h后取材。

1.3神經(jīng)病學(xué)評分 參照Kuluz等〔4〕三級神經(jīng)病學(xué)評分標準。評分如下：0級：大鼠活動正常，無缺陷；1級：大鼠右側(cè)Horner征呈陽性；2級：將大鼠提尾懸空，其左前肢曲屈、內(nèi)收；3級：自主運動時大鼠向偏癱側(cè)(左側(cè))劃圈。腦缺血后，大鼠1、2、3級體征都有的被視為造模成功，可進行后續(xù)試驗。

1.4腦組織病理學(xué)觀察 參照陳春花等〔5〕報道的方法，腹腔麻醉后大鼠進行左心室插管灌注，室溫條件下快速灌注250 ml生理鹽水，4℃條件下緩慢灌注150 ml 4%多聚甲醛1 h左右后快速取腦，6～8 h 4%多聚甲醛溶液固定，再入30%的蔗糖中，待組織沉底后制20 μm厚的冰凍切片，每間隔5張切片取1張，然后將切片進行Nissle染色。

1.5HIF-1α免疫熒光組織化學(xué)法測定 參考陳春花等〔5〕報道的方法，切片在0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)內(nèi)搖洗3次后，Triton X-100液30 min(37℃)，3%過氧化氫20 min(避光)，血清封閉20 min(37℃)，分別滴加1∶100抗HIF-1α抗體于切片上，4℃冰箱過夜。第2天復(fù)溫1 h后PBS搖洗3次，滴加熒光抗體37℃30 min，PBS搖洗3次，37℃恒溫水浴箱20 min，PBS搖洗3次，封片。

2 結(jié) 果

2.1神經(jīng)病學(xué)評分 假手術(shù)組體征無變化；模型組缺血2 h內(nèi)體征為右側(cè)Horner征陽性，提尾時左前肢內(nèi)收、屈曲，爬行時向左劃圈，再灌注后24 h、仍表現(xiàn)為Horner征陽性，提尾時左前肢屈曲內(nèi)收，爬行時向左劃圈；EGB治療組神經(jīng)病學(xué)評分較模型組(15例均為Ⅲ級)有明顯改善，缺血2 h再灌注24 h后46.67%(7例)大鼠評分由Ⅲ級轉(zhuǎn)為Ⅱ級(5例)或Ⅰ級(2例)。

2.2腦組織病理學(xué)觀察 假手術(shù)組：光學(xué)顯微鏡下觀察，大腦皮質(zhì)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)完整、清晰，無水腫現(xiàn)象。神經(jīng)元胞體較大，可見尼氏體核大、淡染、圓且規(guī)整，核仁明顯，染色質(zhì)分布均勻。模型組：神經(jīng)元胞體腫脹，尼氏體減少或溶解，核固縮或溶解。部分神經(jīng)元皺縮，變形呈三角形。EGB治療組：神經(jīng)元胞體仍有腫脹，但腫脹明顯減輕，結(jié)構(gòu)較清晰，核固縮、尼氏體溶解程度均較模型組減輕(圖1)。

圖1 各組腦組織尼氏體(Nissle染色，×400)

2.3HIF-1 α免疫熒光結(jié)果 假手術(shù)組未見HIF-1α表達，模型組HIF-1α表達明顯，EGB治療組HIF-1α表達較MCAO/R組明顯增多(圖2)。

圖2 各組HIF-1α表達(免疫組織化學(xué)，×100)

3 討 論

銀杏被作為藥用植物使用的歷史由來已久，在宋朝時銀杏葉就被用于治療哮喘和支氣管炎。有實驗表明，EGB對高血壓、冠心病、心絞痛、動脈硬化、老年性記憶減退、老年性癡呆、腦功能減退、衰老等與心腦血管循環(huán)有關(guān)的疾病有顯著的預(yù)防和治療效果〔6，7〕。這些研究主要集中在動物神經(jīng)行為學(xué)方面的改善或藥物依賴中的相互作用等方面，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理損傷作用的研究較少。HIF-1主要由α和β兩個亞基構(gòu)成，屬于具有螺旋一環(huán)一螺旋(BHLH)/Per-Arnt-Sim(PAS)結(jié)構(gòu)域的蛋白家族成員。HIF-1的功能實際上依賴于α亞基的蛋白質(zhì)水平與活性〔8〕。HIF-1α在缺氧缺血性腦損傷中起重要作用〔9〕。HIF-1α在全身缺氧、各種缺血腦組織中被激活。永久結(jié)扎成年大鼠大腦中動脈〔10〕，在缺血半影區(qū)，缺血7.5 h后能觀察到HIF-1α mRNA表達上調(diào)，缺血19～24 h達最高值。在HIF-1α mRNA表達上調(diào)的缺血半影區(qū)，局灶性腦血流量減少，推測腦血流量減少致O2供應(yīng)減少，進而誘導(dǎo)HIF-1α mRNA表達增強〔11〕。HIF-1α為一種轉(zhuǎn)錄因子，可對多種基因的轉(zhuǎn)錄進行調(diào)節(jié)，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物能使細胞耗氧量降低，或使缺氧組織的氧供應(yīng)增加，從而緩解氧供與求之間的矛盾，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。機體對缺氧產(chǎn)生了耐受和適應(yīng)，在缺血缺氧導(dǎo)致腦血管病的發(fā)病及病程發(fā)展過中，HIF-1α產(chǎn)生將對其形成保護〔8〕。本研究結(jié)果提示腦缺血再灌注損傷過程中EGB能誘導(dǎo)HIF-1α表達增加，對腦缺血再灌注損傷具有保護作用。