李晶 孔芳翠 于海波 于海濤 薛晴 曹翔

(佳木斯大學(xué) 1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2附屬第一醫(yī)院；3臨床醫(yī)學(xué)院)

由于各種原因造成冠脈血流量降低而致供血不足稱為心肌缺血，同時會出現(xiàn)營養(yǎng)物質(zhì)與氧氣供給不足，甚至出現(xiàn)心肌壞死和凋亡，進而影響循環(huán)系統(tǒng)功能，嚴重者會引起心肌梗死，從而致細胞外基質(zhì)變化出現(xiàn)“失巢凋亡”。常常會同時發(fā)生心力衰竭或休克等危急重癥，這些都是造成心血管疾病高死亡率、高風險、病情進展迅速的原因所在〔1〕。雖然目前經(jīng)皮冠狀動脈介入(PCI)〔2〕可有效緩解心肌缺血癥狀，重新恢復(fù)中斷的血流來減輕心肌損傷，但這也是誘發(fā)心肌細胞壞死、凋亡和心力衰竭的主要原因。血供恢復(fù)后會隨之出現(xiàn)再灌注(I/R)損傷，大多數(shù)是能量代謝紊亂、鈣超載、氧自由基增加等情況出現(xiàn)后伴隨發(fā)生的〔3〕，也稱之為二次心肌損傷。這種I/R損傷又反過來促進原有心肌的損壞，相當于正反饋機制。所以造成壞死的心肌細胞面積、范圍增加，長久的收縮與舒張功能障礙、心律失常等并發(fā)癥的出現(xiàn)?，F(xiàn)階段針對上述問題的出現(xiàn)解決辦法有缺血預(yù)適應(yīng)和缺血后適應(yīng)兩種方案〔4〕。缺血后應(yīng)用不同的手段給予再灌注，只是改善了血液供應(yīng)，但是已經(jīng)壞死、凋亡的心肌細胞卻得不到修復(fù)。所以說，與心肌梗死同時發(fā)生的還有心肌細胞的丟失、心室重構(gòu)等，進而進展為心力衰竭而造成患者死亡〔5〕?；谝陨显颍R床醫(yī)務(wù)工作者的首要任務(wù)就是尋找到既可以削弱心肌重構(gòu)，又可以修復(fù)壞死、凋亡心肌的雙重作用的治療方法和藥物。也就是雙管齊下來控制心肌細胞的多向分化與自我更新能力。心肌缺血發(fā)生發(fā)展過程中常伴隨自由基損傷及氧化應(yīng)激等生化改變。黏著斑激酶(FAK)是一種下游的重要靶蛋白，能夠介導(dǎo)整合素信號通路〔6〕，可通過阻止或抵抗一些信號分子的表達而影響細胞的正常生長發(fā)育過程，比如：細胞存活、黏附、增殖、遷移等生物過程〔7〕。由各種原因造成心肌細胞的能量代謝障礙、進而發(fā)展為心肌冠狀動脈血液供應(yīng)不充分，從而出現(xiàn)心肌細胞的衰老、破壞與死亡，即壞死和凋亡，會進一步啟動心室重構(gòu)，也就是自我修復(fù)過程〔8,9〕。一般在心室重構(gòu)過程中常會出現(xiàn)心肌間質(zhì)的纖維化，即激活了大量的成纖維細胞，細胞外基質(zhì)的沉積及大量膠原纖維的分泌所造成的〔10〕。同時，心室重構(gòu)出現(xiàn)的重要原因也包括氧化應(yīng)激〔11〕。由于缺血缺氧的心肌會因為大量過氧化物、氧自由基的沉積增加而進一步加重心肌細胞的損傷程度〔12〕。細胞凋亡發(fā)生的同時必然伴隨心肌細胞成分的缺失，而進一步加重心力衰竭的病情進展。所以說，治療心肌缺血行之有效的方法就是削弱或抑制凋亡的心肌細胞。靈芝具有扶正固本、延年益壽、補中益氣、促進新生細胞的生長、增加血液供應(yīng)、加強機體免疫力等多方面藥理活性。尤其是靈芝三萜這一具有諸多藥理作用的活性成分在機體各器官系統(tǒng)都可起到調(diào)節(jié)作用，如減少組胺借以止痛、抑制腫瘤細胞的增殖、降低血壓和血糖、促進細胞的新陳代謝等等。本課題通過手術(shù)方式建立心肌缺血模型，并給予靈芝三萜進行灌胃治療，觀察血清指標FAK、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)的變化及心肌酶和心功能、心電圖、心肌梗死面積的改變規(guī)律，探討靈芝三萜的可能作用機制和途徑，為臨床尋找減輕心肌缺血藥物的新靶點提供可行思路。

1 材料與方法

1.1實驗動物與飼養(yǎng)環(huán)境 所有操作經(jīng)佳木斯大學(xué)倫理委員會(批準號JMSU-227)批準后進行，30只Sprague-Dawlay大鼠(SPF級、雄性、體重220 g)購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實驗動物研究所，合格證號SYXK(黑) 2015-001，常規(guī)喂養(yǎng)在佳木斯大學(xué)實驗動物中心〔SYHK(黑)2016-014〕，依據(jù)3R原則給予動物人道關(guān)懷。

1.2主要試劑與儀器 靈芝三萜化合物(康道生物有限公司)；戊巴比妥鈉〔施維雅(天津)制藥有限公司〕；注射用青霉素(哈藥集團制藥總廠)；SOD、MDA試劑盒(南京建成生物公司)；FAK試劑盒(上海一基實業(yè)有限公司)；BL-420F 生物機能實驗系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)；小動物呼吸機(HX-300S，成都泰盟科技有限公司)；各類哺乳動物手術(shù)器械：如手術(shù)剪、眼科剪、鑷子、止血鉗、持針器、手術(shù)線、注射器、眼科開瞼器、擴胸器等。

1.3動物分組與模型制備 依隨機數(shù)字原則分3組：每組手術(shù)前需12 h禁食水，建立缺血模型的具體方案是：大鼠給予戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉，成功后固定在自制的手術(shù)臺上行術(shù)前常規(guī)的消毒、剪毛、切口等操作，然后在喉鏡直視下經(jīng)口氣管插管，并連接小動物呼吸機(各項參數(shù)調(diào)節(jié)如下：呼吸比1∶1，潮氣量15 ml)，保證大鼠的正常通氣量。左胸部4、5肋間開胸結(jié)扎左前降支冠狀動脈是在心電監(jiān)護下完成的。呼吸平穩(wěn)后連接BL-420F 生物機能實驗系統(tǒng)描記心電圖(ECG)，待基線穩(wěn)定后持針器夾手術(shù)線以寬2.0 mm、厚0.5 mm距離穿過左冠狀動脈前降支并結(jié)扎。出現(xiàn)心尖蒼白變淺、ECG中可見明顯抬高的ST段，即造模成功〔13〕。術(shù)畢肌注青霉素抗感染。清醒后行生理鹽水灌胃28 d(常在灌胃前禁食6 h，劑量大小按120 mg/kg)。靈芝三萜組手術(shù)操作步驟同缺血組，灌胃靈芝三萜28 d。假手術(shù)組手術(shù)方案是左前降支冠狀動脈僅穿線并不真正結(jié)扎，灌胃生理鹽水28 d。

1.4ECG觀察 以戊巴比妥鈉腹腔麻醉后，固定仰臥在手術(shù)臺，把5 ml注射器針頭直接插在兩個后肢與右側(cè)前肢的皮下，并按如下要求連接具體電極位置：白-右前肢，紅-左后肢，黑-右后肢。同時間連接好BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)來描記肢體標準Ⅱ?qū)?lián)ECG(電壓1 mV=10 mm、紙速50 mm/s)。

1.5血清心肌酶檢測 收集的2 ml靜脈血在4℃條件下，用高速低溫離心機離心10 min(速度為4 000 r/min)后，于超低溫冰柜中保存?zhèn)溆?，酶標儀測定心肌酶譜〔乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、CK-同工酶(MB)、α-羥丁酸脫氫酶(HBD)〕。操作完全依據(jù)說明進行。

1.6測血清FAK、SOD、MDA變化 試驗結(jié)束后斷頭取血，以10 min、3 000 r/min速度離心，檢測時取上清液。按試劑盒操作說明書按步驟進行。按要求處理后→分別加入平行樣本、標準品及待測品稀釋→加一抗〔辣根過氧化物酶(HRP)標記〕→孵育60 min(37 ℃)→5次磷酸鹽緩沖液(PBS)洗板→加二抗(避光孵育 15 min、37 ℃)→終止液、顯色液加入→測定OD 值(酶標儀、450 nm波長)。用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測血清MDA、SOD、FAK 吸光度后行單位換算。FAK、SOD、MDA試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。保證所有試劑和藥品在有效期限范圍內(nèi)，并嚴格按說明書的操作步驟逐步完成。

1.7梗死面積測定 實驗完成后斷頭處死大鼠并取下心臟，把左心室由心尖到心底部切割為每份厚2 mm組織，進行孵育(10 min、37℃、氯化三苯基四氮唑溶液)后固定(24 h、多聚甲醛)。正常心肌為紅色，梗死區(qū)域為灰白色；梗死面積計算用BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進行。心肌梗死面積=每片切片壞死心肌之和/整個左心室面積×100%。

1.8心功能測定 經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉后，嬰兒理發(fā)器胸部備皮，固定后以小動物專用彩色超聲影像系統(tǒng)(西門子)描記二維圖像，檢測相關(guān)心功能指標，即左心室射血分數(shù)(LVEF)、左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD) 及左心室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)。

1.9統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS21.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1ECG變化 缺血組ST段顯著抬高，靈芝三萜組ST段抬高受抑制。假手術(shù)組未見明顯的ST段。見圖1。

假手術(shù)組

缺血組

靈芝三萜組

2.2心肌酶譜分析 缺血組LDH、CK-MB、CK、α-HBD水平明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)；靈芝三萜組上述指標明顯低于缺血組(P<0.05)。見表1。

表1 各組心肌酶譜比較

2.3各組梗死面積比較 假手術(shù)組心肌沒有明顯的梗死〔梗死面積為(0.0±0.0)%〕，缺血組和靈芝三萜組梗死面積〔(49.86±5.17)%、(26.53±4.39)%〕均顯著大于假手術(shù)組，靈芝三萜組明顯小于缺血組(P<0.05)。

2.4各組血清FAK、SOD、MDA水平變化 與缺血組比，靈芝三萜組血清FAK與MDA水平顯著下降，而血清SOD水平顯著增加(P<0.05)；與假手術(shù)組比，缺血組血清FAK與MDA水平顯著升高，而血清SOD降低水平顯著(P<0.05)，見表2。

表2 各組外周血血清中FAK、SOD、MDA含量

2.5心功能比較 與假手術(shù)組比較，缺血組和靈芝三萜組LVEF顯著降低，LVEDD、LVESD顯著升高(P<0.05)；與缺血組比較，靈芝三萜組LVEF明顯增加，而LVEDD及 LVESD明顯下降(P<0.05)。見表3。

表3 各組超聲心動圖比較

3 討 論

學(xué)者指出：可通過血管再生的方法促進缺血區(qū)灌注血液而強化心功能〔14,15〕。而誘發(fā)心肌梗死的主要原因為冠狀動脈供血供氧不足〔16〕。通常，由于心肌供血供氧不足或需求量加大，可造成心肌缺血，從而引起心肌細胞結(jié)構(gòu)變化，進而使功能、代謝失調(diào)、紊亂〔17〕。

ECG因其檢查方便、簡單、實用，是常用的檢查方法。本研究通過結(jié)扎左前降支冠狀動脈造成心肌缺血，因T波可反映出心肌缺血嚴重程度，故呈現(xiàn)出明顯抬高ST段的異常ECG。靈芝三萜可減弱心肌缺血程度而發(fā)揮心保護功能。

心肌缺血發(fā)生時，可伴隨大量氧自由基生成(具細胞毒性的過氧化終產(chǎn)物MDA)而氧化損傷腦細胞〔18〕，即MDA含量與細胞氧化應(yīng)激損傷呈正相關(guān)；如SOD不斷被消耗(除掉多余自由基)，即SOD含量與自由基間呈負相關(guān)，從而造成不良反應(yīng)，如腦梗死〔19〕。SOD含量高低代表抗氧化水平〔20〕，反映保護細胞結(jié)構(gòu)和功能完整性大小。本研究結(jié)果說明靈芝三萜可通過抑制氧化損傷，保證自由基處于動態(tài)平衡狀態(tài)，降低氧化應(yīng)激和心肌損傷，而起到保護心臟的作用。

在細胞凋亡過程中起作用，且在腦細胞中強表達的FAK可參與多種跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。比如其可作為去除失巢凋亡的目標，是通過整合素介導(dǎo)的信號傳遞發(fā)揮作用的。本研究結(jié)果表明，靈芝三萜可減少FAK、抑制心肌凋亡并經(jīng)整合素信號通路而減弱心肌梗死；還可能是通過削弱FAK上游信號分子、降低FAK活性，調(diào)節(jié)心肌細胞膜的電壓通道而發(fā)揮作用〔21〕。

靈芝三萜是靈芝孢子中發(fā)揮抗缺氧、抗癌、抗衰老、抗炎、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜等生物學(xué)作用的主要功效成分。三萜類有增加機體免疫力、降血壓、降血糖、降血脂等作用〔22〕。綜上：靈芝三萜具有降低氧化應(yīng)激、減輕細胞凋亡而發(fā)揮心肌細胞保護作用。

致謝：感謝黑龍江省北藥與功能食品優(yōu)勢特色學(xué)科建設(shè)項目資助。