張明暉 孫雅麗 趙妍 牛意 白玉勤

(1錦州醫(yī)科大學赤峰市醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地腫瘤內科，內蒙古 赤峰 024000；2赤峰市醫(yī)院腫瘤內科；3赤峰市腫瘤醫(yī)院病理科)

肺癌是世界上死亡率和發(fā)病率都非常高的惡性腫瘤，呈逐年上升趨勢，其中非小細胞肺癌(NSCLC)占絕大多數〔1〕。而傳統(tǒng)的手術和放化療對肺癌的治療有一定的局限性和毒副作用，靶向治療可以針對某一特定位點直接殺死肺癌細胞或抑制其生長，療效好，副作用少，可用于治療肺癌，而更多的特定靶點是靶向治療急需的〔2〕。微小RNA(miRNA)是一類長約22個堿基的非編碼RNA小分子，miRNA參與了細胞的分化、增殖、存活等調節(jié)過程，其異常表達與肺癌的發(fā)生、發(fā)展和預后及耐藥密切相關，miRNA可作為肺癌診斷標志及治療的特異性靶點〔3，4〕。miR-489-3p作為一種miRNA，研究發(fā)現miR-489-3p通過激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)途徑抑制神經元的增殖并促進細胞凋亡〔5〕。miR-489在膀胱癌組織和細胞系中低表達，miR-489過表達抑制人膀胱癌細胞的增殖和侵襲〔6〕。微小染色體維持蛋白(MCM)2是細胞增殖相關因子，只在處于細胞周期的細胞中表達，成熟和靜止期的細胞不表達，NSCLC中MCM2高表達，細胞具有更高增殖活性，MCM2反映NSCLC細胞的增殖能力，對判斷NSCLC的發(fā)展及預后具有一定的臨床意義，為NSCLC的靶向治療提供了潛在的靶點〔7〕。敲低MCM2抑制細胞周期蛋白D1和周期素依賴性激素(CDK)4表達，增加p21和p53表達，表明MCM2沉默引發(fā)細胞周期停滯，且還誘導細胞凋亡〔8〕。MCM2在結直腸癌中也高表達，且與淋巴結轉移，浸潤深度和Dukes分期呈正相關〔9〕。但miR-489-3p在肺癌細胞中的表達及其對肺癌細胞增殖和凋亡的影響，且miR-489-3p是否通過靶向調控MCM2的表達影響肺癌細胞的增殖和凋亡目前還尚未可知。本實驗旨在研究miR-489-3p對肺癌細胞增殖和凋亡的影響及其作用機制與MCM2是否相關。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 肺癌細胞A549、H1299、SPC-A1和正常肺上皮細胞BEAS-2B均購自中國科學院上海細胞庫。胎牛血清(FBS)、RPMI1640培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒和qPCR試劑盒購自日本Takara公司；LipofectamineTM2000轉染試劑盒購自美國Invitrogen公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司；二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、細胞計數試劑盒(CCK)-8、膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙錠(PI)試劑盒購自碧云天生物技術研究所；細胞板、酶標儀購自賽默飛公司。

1.2細胞培養(yǎng) 肺癌細胞A549、H1299、SPC-A1和正常肺上皮細胞BEAS-2B用含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃，含5%CO2恒溫箱培養(yǎng)，每2～3 d傳代一次，取對數生長期細胞用于實驗。

1.3細胞轉染和分組 取常規(guī)培養(yǎng)的肺癌A549細胞消化后接種于96孔板中，待細胞生長至80 %融合，更換為無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，隨后進行轉染。轉染分為miR-NC組(轉染miR-NC)、miR-489-3p組(轉染miR-489-3p mimics)、si-NC組(轉染si-NC)、si-MCM2組(轉染si-MCM2)、anti-miR-NC組(轉染anti-miR-NC)、anti-miR-489-3p組(轉染anti-miR-489-3p)、miR-489-3p+pcDNA組(共轉染miR-489-3p和pcDNA)、miR-489-3p+pcDNA-MCM2組(共轉染miR-489-3p和pcDNA-MCM2)，轉染按照LipofectamineTM2000試劑盒進行操作。

1.4qRT-PCR分析miR-489-3p及MCM2 mRNA表達水平 按照Trizol說明書提取總RNA，用反轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA，按照AceQ qPCR SYBR?Green Mix說明書進行qRT-PCR方法擴增。循環(huán)條件為95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40個循環(huán)；60℃延長5 min。相對表達量采用2-△△Ct法計算。

1.5Western印跡檢測蛋白表達 收集各組細胞，加入放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液裂解，4℃，12 000 r/min離心15 min，收集蛋白上清液，用BCA 蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。各組蛋白上樣量60 μg，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后，經電轉將蛋白轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。用5 %脫脂牛奶室溫封閉90 min，分別加入相應的一抗，4℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，每次5 min；再加入相對應的二抗室溫孵育2 h，PBS洗滌3次，每次10 min，后在暗室中曝光顯影，再浸入定影，最后洗去殘液晾干，將膠片用Quantity One凝膠分析軟件處理，測定各組蛋白條帶的吸光度，以目的條帶和GAPDH條帶的比值作為蛋白表達水平。

1.6CCK-8法測定肺癌細胞增殖 在各組細胞培養(yǎng)至24、48、72 h時每孔加入10 μl CCK-8試劑繼續(xù)孵育2 h。酶標儀測定各孔490 nm波長處OD值。細胞增殖活力(%)=實驗組OD值/空白對照組OD值×100%，每組重復3次取平均值。

1.7流式細胞術檢測細胞凋亡 用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化各組細胞，離心收集各組細胞，PBS漂洗2次，加結合緩沖液重懸細胞。依據試劑盒說明書，先后加入Annexin V-FITC和PI避光孵育。流式細胞儀檢測激發(fā)波長488 nm和發(fā)射波長530 nm處的熒光強度。實驗重復3次。

1.8熒光素酶報告基因檢測實驗檢測miR-489-3p對MCM2的靶向調控 TargetScan數據庫顯示MCM2 3′非編碼區(qū)域(UTR)有miR-489-3p結合位點。構建野生型(WT)和突變型(MUT)基因靶點MCM2的3′UTR-熒光素酶表達載體(WT-MCM2和MUT-MCM2)，取對數生長期肺癌A549細胞接種于24孔板(5×104個/孔)，待細胞生長至80%融合時，用LipofectamineTM2000將WT-MCM2和MUT-MCM2組細胞分別轉染miR-NC和miR-489-3p。依據說明書要求，使用熒光素酶報告基因檢測儀進行雙熒光素酶報告實驗測定。實驗結果以熒光素酶活性和Renilla活性的比值進行統(tǒng)計學分析。實驗重復3次。

1.9統(tǒng)計學分析 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗，方差分析。

2 結 果

2.1miR-489-3p和MCM2在肺癌細胞和正常肺上皮細胞中的表達 相較于正常肺上皮細胞BEAS-2B，肺癌細胞A549、H1299、SPC-A1中miR-489-3p的表達水平顯著降低，MCM2 mRNA的表達水平顯著升高(P<0.05)。與正常肺上皮細胞BEAS-2B相比，肺癌細胞A549、H1299、SPC-A1中MCM2蛋白的表達水平顯著升高(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 Western印跡檢測MCM2蛋白表達

表1 miR-489-3p和MCM2在肺癌細胞和正常肺上皮細胞中的表達

2.2miR-489-3p過表達對肺癌A549細胞增殖的影響 與miR-NC組比較，miR-489-3p組A549細胞中miR-489-3p的表達水平均顯著升高(P<0.05)。與miR-NC組相比，miR-489-3p組A549細胞中細胞周期蛋白(Cyclin)D1表達水平顯著降低，p21、p27蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。與miR-NC組比較，miR-489-3p組A549細胞的活力在48 h和72 h時顯著降低(P<0.05)。見圖2，表2。

圖2 Western印跡檢測增殖相關蛋白的表達

表2 miR-489-3p過表達對肺癌A549細胞增殖的影響

2.3miR-489-3p過表達對肺癌A549細胞凋亡的影響 與miR-NC組相比，miR-489-3p組A549細胞中B細胞淋巴瘤(Bcl)-2蛋白表達水平顯著降低，裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cleaved caspase)-3、Bcl-2相關X蛋白(Bax)蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。與miR-NC組比較，miR-489-3p組A549細胞的凋亡率顯著升高(P<0.05)。見圖3，表3。

圖3 miR-489-3p過表達對肺癌A549細胞凋亡的影響

表3 miR-489-3p過表達對肺癌A549細胞凋亡的影響

2.4抑制MCM2表達對肺癌A549細胞增殖和凋亡的影響 與si-NC組比較，si-MCM2組A549細胞中MCM2、CyclinD1、Bcl-2蛋白表達水平均顯著降低，p21、Bax蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05)。與si-NC組相比，si-MCM2組A549細胞活力在48 h和72 h時顯著降低(P<0.05)。與si-NC組相比，si-MCM2組A549細胞的凋亡率顯著升高(P<0.05)。可見，抑制MCM2表達抑制肺癌A549細胞增殖，促進細胞凋亡。見表4，圖4。

表4 抑制MCM2表達對肺癌A549細胞增殖和凋亡的影響

圖4 Western印跡檢測MCM2和增殖凋亡相關蛋白的表達

2.5miR-489-3p靶向調控MCM2的表達(TargetScan在線軟件) 通過TargetScan數據庫預測到MCM2與miR-489-3p存在結合位點(圖5A)。與miR-NC組比較，miR-489-3p組WT-MCM2肺癌細胞的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)。見表5。Western印跡檢測結果顯示，與miR-NC組(0.58±0.05)比較，miR-489-3p組肺癌細胞中MCM2的表達水平(0.22±0.03)顯著降低；而與anti-miR-NC組(0.56±0.04)比較，anti-miR-489-3p組肺癌細胞中MCM2的表達水平顯著升高(0.93±0.09，P<0.05)。見圖5B。

A：MCM2的3′UTR中含有與miR-489-3p互補的核苷酸序列；B：MCM2蛋白表達圖5 miR-489-3p靶向調控MCM2的表達

表5 雙熒光素酶報告實驗

2.6MCM2過表達逆轉了miR-489-3p過表達對肺癌A549細胞增殖和凋亡的影響 與miR-NC組相比，miR-489-3p組A549細胞中MCM2、CyclinD1、Bcl-2蛋白表達水平顯著降低，p21、Bax蛋白表達水平顯著升高(均P<0.05)；而與miR-489-3p+pcDNA組相比，miR-489-3p+pcDNA-MCM2組A549細胞中MCM2、CyclinD1、Bcl-2蛋白表達水平顯著升高，p21、Bax蛋白表達水平顯著降低(均P<0.05)。與miR-NC組相比，miR-489-3p組A549細胞活力在48 h和72 h時顯著降低；與miR-489-3p+pcDNA組相比，miR-489-3p+pcDNA-MCM2組A549細胞活力在48 h和72 h時顯著升高(均P<0.05)。與miR-NC組相比，miR-489-3p組A549細胞凋亡率顯著升高；與miR-489-3p+pcDNA組相比，miR-489-3p+pcDNA-MCM2組A549細胞凋亡率顯著降低(均P<0.05)。見圖6，表6。

1～4:MiR-NC組、miR-489-3p組、miR-489-3p+pcDNA組、miR-489-3p+pcDNA-MCM2組圖6 MCM2和增殖凋亡相關蛋白的表達

表6 MCM2過表達逆轉了miR-489-3p過表達對肺癌A549細胞增殖和凋亡的影響

3 討 論

肺癌是目前最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病機制之一可能源于致癌啟動基因的突變，因此，針對基因突變的靶向藥物治療的出現為肺癌治療提供了新的方向和新思路〔10〕。miRNA與肺癌細胞的增殖、凋亡，侵襲轉移及耐藥性等密切相關，通過調控相應靶基因的表達和多種信號通路，參與了肺癌的發(fā)生發(fā)展，可作為靶向治療靶點〔11〕。miR-489-3p在多種腫瘤細胞中下調表達，過表達可抑制腫瘤生長，是一種抑癌因子；有研究報道m(xù)iR-489-3p在骨肉瘤細胞中下調表達，通過下調PAX3的表達抑制骨肉瘤細胞的侵襲和轉移〔12〕。miR-489-3p過表達還可抑制膠質瘤細胞的增殖和侵襲〔13〕。miR-489-3p通過調節(jié)Wnt/β-catenin信號通路能抑制宮頸癌細胞的遷移和侵襲〔14〕。此外，miR-489-3p還可以預防缺血性腎損傷〔15〕。本實驗結果顯示，miR-489-3p在肺癌細胞中同樣低表達，miR-489-3p過表達可抑制CyclinD1、Bcl-2蛋白表達水平，促進p21、cleaved caspase-3、Bax蛋白表達；抑制A549細胞增殖活力，促進細胞凋亡。

MCM蛋白家族是DNA復制中的必需因子，起關鍵作用，lnc-FTX與DNA復制許可因子MCM2結合，可阻礙DNA復制并抑制肝癌細胞增殖〔16〕。MCM2是非小細胞肺癌患者生存的獨立預測因子〔17〕。乳腺腫瘤組織中MCM2 mRNA和蛋白表達水平均高，且隨著腫瘤惡性程度的升高呈逐漸增高趨勢〔18〕；MCM2在子宮內膜癌組織中高度表達，與腫瘤的分期、分化程度、淋巴結轉移密切相關〔19〕。MCM2的高表達還與大腸癌肝臟轉移呈正相關〔20〕。本研究結果顯示，肺癌細胞中MCM2也顯著高表達，抑制MCM2表達可抑制CyclinD1、Bcl-2蛋白表達水平，促進p21、cleaved caspase-3、Bax蛋白表達；抑制肺癌A549細胞增殖活力，促進細胞凋亡。而且miR-489-3p可靶向調控MCM2；MCM2過表達還逆轉了miR-489-3p過表達對肺癌A549細胞增殖抑制和凋亡促進的作用。以上結果表明，miR-489-3p可能通過調控MCM2影響肺癌細胞的增殖和凋亡。