張波 白勇濤 劉洪濤 衛(wèi)東鋒 任建廷 張俊英 張占軍 趙雪松

(1香河園社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心檢驗(yàn)科，北京 100028；2中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所；3北京師范大學(xué)認(rèn)知神經(jīng)科學(xué)與學(xué)習(xí)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；4北京師范大學(xué)老年腦健康研究中心；5首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院)

阿爾茨海默病(AD)又稱老年性癡呆，多發(fā)于老年人，是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，臨床以進(jìn)行性記憶和認(rèn)知功能下降、行為異常、社交障礙及睡眠障礙等為主要表現(xiàn)，主要病理特征包括老年斑形成、神經(jīng)元纖維纏結(jié)、海馬錐體細(xì)胞顆粒空泡變性及神經(jīng)元丟失等〔1，2〕。目前外周體液標(biāo)志物的研究已成為AD領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題。由于腦脊液中Aβ和Tau的含量檢測具有一定創(chuàng)傷性無法廣泛開展，而人體外周血作為早期AD診斷、篩查的標(biāo)志物，具有創(chuàng)傷小，易取樣，適合在社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心、醫(yī)院、養(yǎng)老院等廣泛開展。在人體外周血中篩選更為敏感的生物標(biāo)志物是一種具有潛力和臨床應(yīng)用價值的方法〔3，4〕，具有重要的應(yīng)用前景，將對AD的早期篩查和診斷產(chǎn)生重要影響?；蚪M學(xué)檢測方法為AD的病理機(jī)制研究及抗AD藥物研發(fā)提供了大量的臨床數(shù)據(jù)，采用生物信息學(xué)分析方法對這些臨床檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行深入分析，探討AD疾病外周血早期的糖脂代謝變化特征，可為AD疾病的早期篩查、診斷、治療及實(shí)驗(yàn)研究提供科學(xué)依據(jù)〔5〕。

本研究利用來自基因芯片公共數(shù)據(jù)庫(GEO)一組AD患者外周血具有明顯差異的基因數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，深入探討早期AD外周血的糖脂分子功能及蛋白網(wǎng)絡(luò)改變情況，以期為早期AD的發(fā)病機(jī)制及藥物防治提供理論依據(jù)和臨床參考。

1 材料與方法

1.1差異明顯的基因表達(dá)數(shù)據(jù) 在GEO DataSets Advanced Search Builder搜索框中以“血液和阿爾茨海默病”為檢索詞，獲得GSE97760和GSE4229基因芯片數(shù)據(jù)。GSE97760由美國Agilent 科技公司生產(chǎn)的Sureprint G3 Human Gene Expression 8x60k v2基因芯片檢測，基因數(shù)據(jù)分別來自9例AD患者和10例健康老年人。GSE4229為人外周血單個核細(xì)胞基因芯片數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)由NIA Human MGC cDNA基因芯片檢測，基因數(shù)據(jù)分別來自18例AD患者和22例正常老年人。AD患者血液中表達(dá)明顯下調(diào)和上調(diào)的差異基因列表見表1，然后進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

表1 AD患者血液中表達(dá)下調(diào)及上調(diào)的差異基因

1.2方法

1.2.1差異表達(dá)基因的蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)分析 分別將20個表達(dá)下調(diào)和上調(diào)的明顯差異基因相應(yīng)的蛋白ID號上傳至STRING9.05 PPI關(guān)系在線分析網(wǎng)站(http://www.string-db.org)，通過調(diào)節(jié)可信度和附加節(jié)點(diǎn)參數(shù)，獲得差異表達(dá)基因的PPI拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)圖譜及團(tuán)簇功能分類網(wǎng)絡(luò)圖譜，并篩選出各子網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)蛋白。

1.2.2差異表達(dá)基因的分類及分子功能分析 分別將20個表達(dá)下調(diào)和上調(diào)的明顯差異基因ID號上傳至PANTHER 8.1在線分類系統(tǒng)(http://www.pantherdb.org)，通過調(diào)節(jié)數(shù)據(jù)種屬類型及分析類型參數(shù)，調(diào)節(jié)結(jié)果展示圖形類別，分別獲得上調(diào)和下調(diào)差異基因表達(dá)蛋白的分類、基因分子功能分類結(jié)果，進(jìn)一步查看各分類中詳細(xì)基因名稱及相關(guān)信息，對分類結(jié)果進(jìn)行整理。

1.2.3差異表達(dá)基因的生物學(xué)過程及信號通路分析 在上述數(shù)據(jù)上傳的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步調(diào)節(jié)分析參數(shù)及結(jié)果展示類型，點(diǎn)擊各生物學(xué)過程及信號通路分析結(jié)果，進(jìn)一步查看各生物學(xué)過程中所包含的所有基因名稱及其詳細(xì)信息，并查看每條信號通路中所涉及的基因數(shù)量、基因名稱等相關(guān)信息。

2 結(jié) 果

2.1下調(diào)基因的PPI拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)及團(tuán)簇網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果 如圖1所示，STRING蛋白相互作用在線分析結(jié)果表明，下調(diào)的20個基因表達(dá)的蛋白之間存在相互作用關(guān)系，構(gòu)成的蛋白拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)中包含3個子網(wǎng)絡(luò)，分別與能量代謝、信號傳導(dǎo)、氧化應(yīng)激密切相關(guān)。其中，ATP6V1F為能量代謝子網(wǎng)絡(luò)的中心節(jié)點(diǎn)，與子網(wǎng)絡(luò)中其他16個蛋白存在相互作用關(guān)系。PIGQ與信號傳導(dǎo)子網(wǎng)絡(luò)中的4個信號傳導(dǎo)蛋白存在相互作用關(guān)系，為關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。SLC2A5與網(wǎng)絡(luò)中的兩個蛋白存在相互作用關(guān)系。GP6與網(wǎng)絡(luò)中的GP1BB蛋白存在相互作用關(guān)系，GLO1為子網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，與AK1、HAGH存在相互作用關(guān)系。下調(diào)基因表達(dá)蛋白相互作用拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)中預(yù)測的相關(guān)功能蛋白見表2，表中列出了10個預(yù)測蛋白的全稱及所含氨基酸數(shù)目。而下調(diào)基因的PPI功能團(tuán)簇網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果見圖2，包含3個功能團(tuán)簇。

2.2上調(diào)基因的PPI拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)及團(tuán)簇網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果 如圖3所示，STRING蛋白相互作用在線分析結(jié)果表明，上調(diào)的20個基因表達(dá)的蛋白之間存在相互作用關(guān)系，構(gòu)成的蛋白拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)中包含5個子網(wǎng)絡(luò)，分別與糖基化修飾、糖原合成、丙三醇代謝、葡萄糖醛酸酯合成及ATP能量代謝密切相關(guān)。其中，OGT為糖基化修飾相關(guān)子網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，與子網(wǎng)絡(luò)中的其他3個蛋白MGEA5、HCFC1、WDR5存在相互作用關(guān)系。GYG1為糖原合成子網(wǎng)絡(luò)的中心節(jié)點(diǎn)，與子網(wǎng)絡(luò)中的其他10個蛋白存在相互作用關(guān)系。UXS1為葡萄糖醛酸酯合成相關(guān)子網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，與子網(wǎng)絡(luò)中的其他4個蛋白B3GALNT2、POMK、ATPIF1、UGDH存在相互作用關(guān)系。ATP2A2為ATP能量代謝子網(wǎng)絡(luò)的中心節(jié)點(diǎn)，與子網(wǎng)絡(luò)中的其他7個蛋白ATP2A1、ATP2A3、ATP1B1、ATP1A4、ATP1A2、ATP1A1、FXYD2存在相互作用關(guān)系。上調(diào)基因表達(dá)蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)中預(yù)測的相關(guān)功能蛋白見表2，表中列出了10個預(yù)測蛋白的全稱。上調(diào)基因的PPI團(tuán)簇網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果見圖2，包含3個功能團(tuán)簇。

圖1 下調(diào)基因的PPI相互作用拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)

下調(diào)基因

上調(diào)基因

2.3下調(diào)基因的GO分類結(jié)果 下調(diào)基因的GO分類結(jié)果包括蛋白分類(蛋白總數(shù)20，分類匹配數(shù)目16)、分子功能(蛋白總數(shù)20，功能匹配數(shù)18)、生物學(xué)過程(蛋白數(shù)20，過程匹配數(shù)18)及信號通路(蛋白總數(shù)20，通路匹配數(shù)目4)。

2.3.1下調(diào)基因的蛋白分類及分子功能分析結(jié)果 PANTHER平臺蛋白分類結(jié)果表明，下調(diào)基因表達(dá)的蛋白可分為8個類別，每種類別包含的基因及占總基因數(shù)量的百分比見表3。PANTHER平臺分子功能分類結(jié)果表明，下調(diào)基因的分子功能可分為4個類別，每種分子功能包含的基因及占總基因數(shù)量的百分比見表4。

圖3 上調(diào)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)

2.3.2下調(diào)基因的生物學(xué)過程及信號通路分析結(jié)果 PANTHER平臺生物學(xué)過程分類結(jié)果表明，下調(diào)基因的生物學(xué)過程可分為6個類別，每種生物學(xué)過程包含的基因及占總基因數(shù)量的百分比見表4。

2.4上調(diào)基因的GO分類結(jié)果 上調(diào)基因的GO分類結(jié)果包括蛋白分類、分子功能、生物學(xué)過程及細(xì)胞組分。

2.4.1上調(diào)基因的蛋白分類及分子功能分類結(jié)果 PANTHER平臺蛋白分類結(jié)果表明，上調(diào)基因表達(dá)的蛋白可分為6個類別，每種類別包含的基因及占總基因數(shù)量的百分比見表3。上調(diào)基因的分子功能可分為4個類別，包括結(jié)合活性、催化活性、分子調(diào)節(jié)及轉(zhuǎn)運(yùn)活性，每種分子功能包含的基因及占總基因數(shù)量的百分比見表5。

表3 下調(diào)基因及上調(diào)基因表達(dá)蛋白的分類結(jié)果

表4 下調(diào)基因的生物信息學(xué)分析

2.4.2上調(diào)基因的生物學(xué)過程及細(xì)胞組分分類 PANTHER平臺生物學(xué)過程分類結(jié)果表明，上調(diào)基因的生物學(xué)過程可分為4個類別，每種生物學(xué)過程包含的基因及占總基因數(shù)量的百分比見表5。

表5 上調(diào)基因的生物信息學(xué)分析

3 討 論

AD是一種病因較多、病程較長、危險因素較多、發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜的神經(jīng)退行性疾病，由于其發(fā)病機(jī)制研究尚未有定論，因此目前仍缺乏有效的治療方法〔6,7〕。已有研究表明，由β淀粉樣蛋白(Aβ)聚集所形成的老年斑和Tau蛋白過度磷酸化引起的神經(jīng)纖維纏結(jié)是AD的主要病理特征，寡聚化的Aβ對神經(jīng)細(xì)胞具有明顯毒性作用，其機(jī)制與線粒體能量代謝障礙、氧化應(yīng)激損傷、炎癥反應(yīng)、突觸損傷、Tau蛋白磷酸化、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞代謝紊亂密切相關(guān)〔8〕。Tau蛋白過度磷酸化可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞微管結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性下降、神經(jīng)纖維纏結(jié)、囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)功能失調(diào)及軸突轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，從而引起神經(jīng)細(xì)胞損傷或丟失〔9〕。線粒體能量代謝紊亂是AD早期發(fā)生的主要原因之一，進(jìn)而導(dǎo)致脂代謝和氨基酸代謝紊亂，引起神經(jīng)細(xì)胞微環(huán)境紊亂，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)功能重塑，以維持大腦的正常生理功能〔10〕。

本研究中基因數(shù)據(jù)來源于AD患者血液，差異基因主要與能量代謝密切相關(guān)。下調(diào)基因表達(dá)的蛋白主要與轉(zhuǎn)移酶、水解酶、轉(zhuǎn)運(yùn)分子、細(xì)胞黏附分子、防御/免疫蛋白密切相關(guān)，分子功能主要與催化活性、轉(zhuǎn)運(yùn)活性、結(jié)合活性密切相關(guān)，涉及的生物學(xué)過程主要與能量代謝過程、細(xì)胞過程、免疫系統(tǒng)過程及定位過程密切相關(guān)，如Na+/K+轉(zhuǎn)運(yùn)三磷酸腺苷酶β2多肽、氫離子轉(zhuǎn)運(yùn)三磷酸腺苷酶V1亞基、丙酮酸羧化酶、甘露糖(α-1,3-)-糖蛋白-2-N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶、溶質(zhì)載體家族2促葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體成員A5、溶質(zhì)載體家族5促葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體成員A2。而上調(diào)基因表達(dá)的蛋白主要與轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)運(yùn)分子、氧化還原酶、分子伴侶、連接酶密切相關(guān)，分子功能主要與催化活性、轉(zhuǎn)運(yùn)活性及分子調(diào)節(jié)密切相關(guān)，涉及的生物學(xué)過程主要與代謝過程、細(xì)胞過程、生物調(diào)節(jié)過程及定位過程密切相關(guān)，如鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)三磷酸腺苷酶、溶質(zhì)載體家族5促葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體成員A3、丙三醇激酶、線粒體丙三醇-3-磷酸鹽酰基轉(zhuǎn)移酶、線粒體丙三醇-3-磷酸脫氫酶2、增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)降解的甘露糖苷酶樣蛋白3等。PANTHER平臺GO分析結(jié)果表明，AD病理過程中，機(jī)體線粒體能量代謝、免疫系統(tǒng)防御功能及細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)能力明顯下降，而機(jī)體的生物調(diào)節(jié)能力、分子調(diào)節(jié)能力及氧化應(yīng)激反應(yīng)等代償性調(diào)節(jié)能力明顯增強(qiáng)。這可能是機(jī)體出現(xiàn)損傷后的一種局部功能重塑，通過基因的整體變化達(dá)到新的代謝平衡。

STRING PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果表明，AD患者血液中的差異基因表達(dá)的蛋白之間存在相互作用關(guān)系，下調(diào)基因表達(dá)蛋白的PPI蛋白子網(wǎng)絡(luò)與能量代謝、信號傳導(dǎo)、氧化應(yīng)激密切相關(guān)，而上調(diào)基因表達(dá)蛋白的PPI蛋白子網(wǎng)絡(luò)與糖基化修飾、糖原合成、丙三醇代謝、葡萄糖醛酸酯合成及ATP能量代謝密切相關(guān)，其中ATP6V1F、PIGQ、GLO1、OGT、GYG1、UXS1、ATP2A2作為PPT網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)值得進(jìn)一步深入研究，為AD的早期篩查和診斷提供線索和依據(jù)。

本研究差異基因的生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，AD患者外周血中的差異基因主要涉及催化活性、轉(zhuǎn)運(yùn)活性、結(jié)合活性及分子調(diào)節(jié)功能，通過調(diào)節(jié)AD丙酮酸代謝、血凝、嘌呤生物合成信號通路參與能量代謝過程、細(xì)胞過程、免疫系統(tǒng)及細(xì)胞定位生物學(xué)過程，為早期AD患者的外周血早期篩查及診斷研究提供了新思路和防治靶標(biāo)。綜上所述，本研究應(yīng)用生物信息學(xué)方法對AD患者血液中表達(dá)下調(diào)和上調(diào)的差異基因進(jìn)行了深入分析，篩選出了其中7個重要調(diào)節(jié)基因，以細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路為主，針對這些差異基因進(jìn)行深入研究，將有助于進(jìn)一步揭示AD在早期階段的發(fā)病機(jī)制。