吳炳 張涵斌 柯淑慧 池宏波

(1浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310000；2臺州市椒江區(qū)婦幼保健院檢驗科；3臺州市黃巖區(qū)婦幼保健院檢驗科；4臺州市恩澤醫(yī)療中心恩澤醫(yī)院檢驗科)

慢加急性肝衰竭(ACLF)是一種嚴(yán)重的肝臟損傷，病死率極高。臨床主要表現(xiàn)為黃疸和凝血障礙，并合并有肝性腦病、腹水等并發(fā)癥〔1〕。ACLF的病變基礎(chǔ)可能是肝硬化，也可能是無肝硬化的慢性肝病，ACLF 28 d死亡率高達33%，是其他慢性肝病的15倍〔2〕。我國ACLF最常見的病因是乙型肝炎病毒(HBV)感染，被稱之為HBV-ACLF〔3〕。常用的評估和預(yù)后手段如終末期肝病模型(MELD)和Child-Pugh評分，均不是專門為ACLF設(shè)計的。因此制定正確治療方案和準(zhǔn)確評估ACLF患者的預(yù)后是治療ACLF的關(guān)鍵，這樣才能有效降低ACLF患者死亡率。由于HBV-ACLF預(yù)后很差，所以迫切需要篩選出新的潛在生物標(biāo)志物來診斷和預(yù)測HBV-ACLF患者的預(yù)后，為臨床治療方案提供實驗基礎(chǔ)。微小RNA(miRNA)是一類長18～24個核苷酸的單鏈編碼RNA。它可通過與mRNA的3′UTR結(jié)合來調(diào)節(jié)基因的表達〔4〕。已經(jīng)證實miRNA參與了肝損傷和肝衰竭的過程，例如大鼠熱缺血再灌注后肝損傷后循環(huán)miR-122的相對表達水平升高，血清miR-21水平升高和肝臟miR-223相對表達升高；miR-122的相對表達與血清天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和乳酸脫氫酶(LDH)活性相關(guān)，可作為熱缺血再灌注后肝損傷的潛在標(biāo)志物〔5〕。在乙酰氨基酚引起的急性肝衰竭模型中，microRNAs被動釋放到循環(huán)中；在miR-122、miR-192和miR-124-1顯著升高之前，總microRNA顯著升高，并與肝、腎和腦損傷的臨床證據(jù)密切相關(guān)〔6〕。尤其是一些特殊的miRNA可作為肝衰竭預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物，例如HBV-ACLF患者血清miR-125b-5p水平隨病情進展而升高，存活者血清miR-125b-5p水平低于死亡的HBV-ACLF患者；miR-125b-5p表達與總膽紅素和MELD評分呈正相關(guān)，與凝血酶原活性(PTA)呈負(fù)相關(guān)〔7〕。研究發(fā)現(xiàn)，在無ACLF和ACLF患者之間有20個miRNAs改變，與存活患者相比，在30 d內(nèi)死亡的患者中有27個miRNAs改變；通過驗證發(fā)現(xiàn)ACLF患者和30 d內(nèi)死亡的患者miR-223-3p和miR-25-3p表達的降低與ACLF的存在和預(yù)后不良有關(guān)〔8〕。因此，一些miRNAs可能在ACLF包括HBV-ACLF中有作為生物學(xué)標(biāo)志物應(yīng)用于臨床的潛力。通過微陣列分析技術(shù)，Zheng等〔9〕篩選出很多miRNAs，在HBV-ACLF患者的血清中9個miRNAs表達顯著上調(diào)(miR-21，miR-486-5p，miR-130a，miR-192，miR-148a，miR-143，miR-200a，miR-194，miR-122)。該研究證實恢復(fù)期ACLF患者血清miR-130a和miR-486-5p表達明顯高于未恢復(fù)期ACLF患者，血清miR-130a與國際標(biāo)準(zhǔn)化比值、凝血酶原時間(PT)、MELD呈負(fù)相關(guān)，與PTA呈正相關(guān)，提示miR-130a可能是HBV-ACLF患者有用的預(yù)后標(biāo)志物。由于該研究沒有對miR-200a在HBV-ACLF中的表達進行進一步驗證，未深入探究其臨床相關(guān)性，本研究探討miR-200a在HBV-ACLF患者血清中的表達，并進一步探究其臨床意義。

1 材料與方法

1.1臨床資料 選擇臺州市椒江區(qū)婦幼保健院HBV-ACLF患者42例納入HBV-ACLF組，平均年齡(65.3±13.1)歲；無癥狀乙肝病毒攜帶者(ASC，30例納入ASC組，平均年齡(62.7±14.2)歲；慢性乙型肝炎(CHB)患者30例納入CHB組，平均年齡(64.5±12.9)歲。患者入院后收集基本資料，各指標(biāo)檢查由醫(yī)院檢驗科完成，ASC、CHB和HBV-ACLF的診斷依據(jù)慢性乙型肝炎防治指南(2015版)〔10〕和肝衰竭診治指南(2012年版)〔11〕。

1.2實驗試劑和設(shè)備 患者所做各項實驗室指標(biāo)檢查的試劑和儀器由美國貝克曼庫爾特有限公司提供，TRIzolTMLS Reagent 試劑盒SYBR Green Ⅱ熒光染料(Invitrogen公司，美國)、Revert Aid First Stand cDNA synthesis kit試劑盒、酶標(biāo)儀(MultiskanTMFC，Thermo Fishers公司，美國)、ABI 7900系統(tǒng)(Applied Biosystems公司，美國)。

1.3各組血清miR-200a表達的檢測 患者入院第2天清晨空腹采靜脈血，在室溫下靜置30 min后，1 500 r/min離心20 min分離血清，留存血清于-80℃待檢測。采用實時熒光定量PCR(qPCR)法檢測各組血清miR-200a表達；并分析血清中miR-200a表達水平與HBV-ACLF預(yù)后的關(guān)系。

1.4qPCR檢測方法 使用TRIzolTMLS Reagent試劑盒提取血清中總RNA。根據(jù)沉淀量加入20 μl高溫滅菌去離子水溶解RNA，并使用酶標(biāo)儀測定RNA的純度(260/280)及濃度。根據(jù)測得的RNA濃度，使用Revert Aid First Stand cDNA synthesis kit試劑盒和1 μg RNA進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，加入180 μl去離子水稀釋逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA，保存于-20℃?zhèn)溆?。根?jù)說明書，使用SYBR Green Ⅱ熒光染料(Invitrogen) 及ABI 7900系統(tǒng)(Applied Biosystems)檢測miR-200a的表達。以U6 snRNA的相對表達量為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt相對定量法進行統(tǒng)計分析。引物序列為：miR-200a，正義鏈：5′-TAACACTGTCTGGTAACGATG-T，反義鏈：5′-CATCTTACCGGACAGTGCTGGA；U6，正義鏈：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA，反義鏈：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS18.0軟件進行t及χ2檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組臨床資料比較 3組年齡、性別及HBV-DNA定量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。3組血小板計數(shù)(PLT)、總膽紅素(TBIL)、ALT、AST、MELD評分、PT和血清白蛋白(ALB)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組臨床資料比較

2.23組血清miR-200a表達的比較 與ASC組(0.61±0.31)和CHB組(0.86±0.45)相比，HBV-ACLF組(2.58±1.22)血清miR-200a表達明顯增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)差異 (均P<0.001)。受試者工作特征(ROC)曲線分析顯示miR-200a的表達對于區(qū)分HBV-ACLF和ASC或CHB價值明顯優(yōu)于區(qū)分ASC和CHB。見表2。

表2 3組血清miR-200a表達區(qū)分比較

2.3HBV-ACLF組生存患者與死亡患者血清miR-200a表達比較 13例死亡HBV-ACLF患者血清miR-200a 表達(3.66±1.06，n=13)明顯高于29例生存患者(2.10±0.96，n=29，P<0.001)。ROC曲線顯示miR-200a的表達對HBV-ACLF預(yù)后具有很好的預(yù)測價值(AUC=0.862，P<0.001)。

3 討 論

miRNA可穩(wěn)定表達于血液、血清等體液中，而且在不同疾病中表達譜不同，因而循環(huán)miRNA可作為潛在的生物學(xué)標(biāo)志物用于疾病診斷和預(yù)后判斷。例如在急性心肌梗死后心力衰竭中，血清循環(huán)miR-150水平顯著降低，其表達水平與急性心肌梗死后心力衰竭獨立相關(guān)，血清循環(huán)miR-150是一種預(yù)測急性心肌梗死后心力衰竭新的生物標(biāo)志物〔12〕。在胰腺癌中血清miR-1290和miR-1246表達上調(diào)，分別與腫瘤的分期和大小有關(guān)，且都是胰腺癌的獨立危險因素；血清miR-1290和miR-1246可能是胰腺癌診斷有潛在的生物標(biāo)志物〔13〕?；顒有韵到y(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、非活動性SLE和健康對照組 miR-371b-5p和miR-5100的表達存在差異，且miR-371b-5p和miR-5100的表達水平與SLE患者的臨床參數(shù)之間存在相關(guān)性，提示miR-371b-5p和miR-5100可能是SLE的血清標(biāo)志物。在HBV-ACLF中，凋亡、壞死的肝細(xì)胞可將細(xì)胞內(nèi)合成的miRNA釋放到血液循環(huán)系統(tǒng)中〔14，15〕，因此，血液中異常表達的miRNA也可作為診斷HBV-ACLF和評價預(yù)后的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。本研究結(jié)果表明，miR-200a不僅是肝脂肪變性的一個階段依賴性生物標(biāo)志物，而且是人類免疫缺陷病毒(HIV)患者脂肪變性進展和肝細(xì)胞損傷的預(yù)測因子〔16〕。同時也有研究者發(fā)現(xiàn)miR-200a可作為ART治療的HIV-1感染者致命肝病的生物標(biāo)志物〔17〕?？梢妋iR-200a在肝細(xì)胞損傷中發(fā)揮了重要作用，然而在HBV-ACLF并沒有miR-200a相關(guān)研究。本研究結(jié)果可能是由于ASC、CHB和HBV-ACLF患者不同的肝細(xì)胞損傷程度，且HBV-ACLF往往伴隨非常嚴(yán)重的肝細(xì)胞壞死。