高亮亮，錢令芝，張 霞

(安徽科技學(xué)院，安徽 鳳陽 233100)

女貞子(Ligustrilucidum)，別名白蠟樹、楨木、將軍樹、冬青，是木犀科女貞屬常綠灌木或喬木的果實。其外觀是橢圓形或腎形，成熟后表皮呈紫黑色，主要分布于中國長江流域及南方各地，安徽等地也有大量種植[1]。在古醫(yī)書中，將女貞子稱作冬青，是在女貞子冬季成熟之后采摘，與其它藥材配伍使用作為一劑治療少白頭，補肝腎的藥材使用。

黃酮類化合物是女貞子的主要成分，具有降血壓、降血脂、保肝護肝、抗炎抗病毒等生理活性[2]，它是一種天然的抗氧化劑；同時，黃酮還具有抑制癌細胞增殖和降低腫瘤細胞的耐藥性等作用[3-5]。

女貞樹極易種植，對氣候和土壤要求不嚴格，而且很耐低溫，因此安徽省內(nèi)有女貞樹大量種植的適宜條件。目前國內(nèi)對女貞子的研究雖然也有很多，但對安徽本地女貞子的研究還較少。植物的藥物含量受地域氣候的影響較大，而女貞子是安徽省內(nèi)比較豐富的植物資源，因其樹形茂密整齊，是常用的觀賞樹種，且具有很高的藥用價值[6]。故本論文研究安徽省本地的女貞子中黃酮類成分的最佳提取工藝，為安徽省女貞子資源得到充分開發(fā)和生產(chǎn)提供切實可靠參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

女貞子藥材(2018年11月采于安徽科技學(xué)院鳳陽校區(qū)內(nèi))；蘆丁標準品，乙醇，NaOH，NaNO2，Al(NO3)3等試劑均為分析純，購于國藥試劑有限公司。

1.2 試驗儀器

ESJ182-4分析天平(佑科儀器)；XFB-400高速中藥粉碎機(吉首市中州制藥機械廠)；UV-5500 紫外分光光度計(上海元析儀器有限公司)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海森信實驗儀器有限公司)；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州普天儀器制造有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品溶液的制備 精密稱取1 g女貞子粗粉置于250 mL圓底燒瓶中，按一定料液比加入一定體積百分濃度的乙醇溶液,根據(jù)試驗條件水浴回流浸提完成后，抽濾，保存濾液作供試品溶液備用。

1.3.2 對照品溶液的配制 將蘆丁標準品干燥至恒重，精密稱取標準品10.7 mg于100 mL容量瓶中，加無水乙醇溶液使其完全溶解后，再用無水乙醇定容至刻度，充分搖勻，即得濃度為0.107 mg/mL的蘆丁對照品溶液，備用。

1.3.3 女貞子黃酮類化合物提取率測定 黃酮的提取率(mg/g)=C×V×N×106/M。其中，C：稀釋后供試品中黃酮的濃度(μg/mL)，V：乙醇溶劑的體積(mL)，N：提取液稀釋倍數(shù)，M：女貞子粉末質(zhì)量(g)。

1.3.4 單因素試驗實驗 以乙醇體積分數(shù)(40%、50%、60%、70%、80%)、回流溫度(60、70、80、90、95 ℃)、回流時間(0.5、1、1.5、2、2.5 h)、料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50)四個因素的五個水平，來進行單因素試驗[7]。

1.3.5 響應(yīng)面法優(yōu)化實驗設(shè)計 在得出單因素實驗最佳水平后，運用Design Expert 8.0.6軟件來設(shè)計四因素三水平響應(yīng)面實驗。該響應(yīng)面實驗?zāi)軌蛲瑫r對影響女貞子中黃酮提取率的乙醇體積分數(shù)、提取時間、料液比、提取溫度交叉影響作用進行考察[5]。探索這些綜合因素對于女貞子黃酮成分提取率的影響的大小，同時通過軟件分析建立起各因素影響提取率的數(shù)學(xué)模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 繪制標準曲線

以縱坐標為吸光度A，橫坐標為濃度C(μg/mL)繪制蘆丁標準曲線[8]，結(jié)果見圖1。

圖1 蘆丁的標準曲線

2.2 女貞子黃酮類化合物提取的單因素實驗結(jié)果

精密稱取1 g女貞子粗粉置于250 mL圓底燒瓶中，按料液比1∶30加入70%的乙醇溶液，用80 ℃水浴回流浸提1 h，抽濾，保存濾液作供試品溶液備用。

2.2.1 乙醇體積分數(shù)對于黃酮提取率的影響 在女貞子水浴回流提取黃酮類化合物的單因素試驗中，當(dāng)以乙醇的體積分數(shù)為自變量，控制其他實驗條件保持不變。女貞子中黃酮類化合物的提取率隨著自變量的增大，呈現(xiàn)先增大后減小，當(dāng)自變量乙醇的體積分數(shù)值為70%時，因變量女貞子黃酮類化合物的提取率的值達到最大，為3.515 mg/g；當(dāng)自變量的值超過70%后，提取率開始逐漸降低。因此,70%乙醇的體積分數(shù)提取女貞子中黃酮類化合物較為合適(圖2)。

圖2 乙醇體積分數(shù)對于女貞子中黃酮類化合物提取率的影響

2.2.2 料液比對于黃酮提取率的影響 在女貞子水浴回流提取黃酮類化合物的單因素試驗中，以料液比為自變量，控制其它實驗條件保持不變時。當(dāng)自變量料液比達到1∶30時，女貞子中黃酮類化合物的提取率最大，為4.541 mg/g。因此,料液比1∶30提取女貞子中黃酮類化合物較為合適(圖3)。

圖3 料液比對于女貞子中黃酮類化合物提取率的影響

2.2.3 提取時間對于黃酮提取率的影響 當(dāng)以提取時間為自變量，其它實驗條件保持不變時，在0.5～1 h的回流提取時間范圍內(nèi)，女貞子中黃酮類化合物的提取率呈現(xiàn)增長的趨勢；當(dāng)達到1 h的回流提取時間時，女貞子中黃酮類化合物的提取率最大，為4.488 mg/g；因此,選擇回流提取時間為1 h是提取女貞子中黃酮類化合物最佳提取時間(圖4)。

圖4 回流提取時間對于女貞子中黃酮類化合物提取率的影響

2.2.4 提取溫度對于黃酮提取率的影響 以提取溫度為自變量，控制其它實驗條件保持不變。在60～80 ℃的水浴回流提取溫度范圍內(nèi)，女貞子中黃酮類化合物的提取率逐漸增大；當(dāng)達到80 ℃的回流提取溫度時，女貞子中黃酮類化合物的提取率達到最大，為4.286 mg/g；因此,提取溫度為80 ℃時是提取女貞子中黃酮類化合物最佳提取溫度(圖5)。

圖5 提取溫度對于女貞子中黃酮類化合物提取率的影響

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化實驗的結(jié)果

2.3.1 實驗設(shè)計與結(jié)果 通過單因素實驗的結(jié)果，選取乙醇濃度(A)、回流時間(B)、回流溫度(C)、料液比(D)4個因素做Box-Behnken設(shè)計，同時以黃酮提取率作為響應(yīng)值，試驗因素水平及編碼見表1。

表1 Box-Behnken 因素與水平的實驗編碼

表2 響應(yīng)面分析法結(jié)果

采用Design Expert8.0.6軟件進行多元擬合回歸分析[9-10]，得到黃酮類化合物的提取率(Y)與乙醇濃度(A)、回流時間(B)、回流溫度(C)、料液比(D)的二次多項回歸方程：Y=53.66+2.40A+6.98B+1.93C+0.024D-0.044AB-3AC-4AD-0.027BC+0.091BD-3CD-0.013A2-1.49B2-3C2-0.01D2。最佳提取率的理論值為5.437 6 mg/g。

表3 女貞子中黃酮類化合物的提取回歸方程系數(shù)的方差分析結(jié)果

由表3可知，model中F=3.23，P<0.001，說明本試驗所采用的二次模型是極顯著的；并且乙醇濃度與回流溫度交互項對女貞子中的黃酮提取率有較顯著的影響；決定系數(shù)R2的值為0.923 5，越接近1，實驗誤差越小，所以用該模型預(yù)測和分析實驗的結(jié)果可靠。

2.3.2 四個因素的交互作用 女貞子中黃酮類化合物提取率的三維立體圖如圖6所示。

圖6 四個因素交互作用對提取率影響的等高線及響應(yīng)面

根據(jù)圖6可知，對女貞子中黃酮類化合物提取率的影響程度由高到低分別為：回流時間B>回流溫度C>料液比D>乙醇濃度A，對提取率影響的大小順序為AC>BD>CD>AB，其中乙醇濃度與提取溫度對于提取率影響較大(P=0.04<0.05)。

2.3.3 驗證試驗 由于該系統(tǒng)分析得到的實驗條件過于精細，不方便實際實驗及生產(chǎn)的測量，配制以及控制；所以為了使其易于具體的實驗及生產(chǎn)操作，故將女貞子中黃酮類化合物的提取工藝的最優(yōu)提取條件修正為溶劑比70%、料液比1∶32、水浴提取溫度79 ℃，回流提取1.25 h，此時得到的最佳提取率為5.437 6 mg/g，與預(yù)測值5.437 6 mg/g幾乎誤差為零，因此實驗結(jié)果可被實際操作使用，并應(yīng)用于今后的實際生產(chǎn)中。

3 結(jié)論與討論

本實驗在單因素試驗所得的最優(yōu)黃酮提取條件的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面分析法對女貞子中黃酮類化合物的提取工藝進行優(yōu)化，并建立了單因素與響應(yīng)值之間的數(shù)學(xué)模型，研究結(jié)果顯示，在溶劑比70%、料液比1∶32、水浴提取溫度79 ℃，提取時間1.25 h的條件下，得到最佳提取率為5.437 68 mg/g。同時經(jīng)驗證實驗，提取率實際值與預(yù)測值相差較小，結(jié)果可靠。本實驗采用的響應(yīng)面法，避免了正交實驗的各種缺點，使優(yōu)化結(jié)果的數(shù)據(jù)更加精準可靠。為今后的大量生產(chǎn)和試驗提供了可靠的數(shù)據(jù)支撐，為安徽省內(nèi)女貞子的更好開發(fā)利用提供參考。