譚鳳霞，柴 毅，彭 夢，楊代勤

(長江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北省黃鱔工程技術(shù)研究中心，湖北 荊州 434025)

黃鱔(Monopterusalbus)是廣泛分布于我國南北水域的一種名優(yōu)養(yǎng)殖品種，隨著養(yǎng)殖密度的加大造成水體環(huán)境的惡化等因素引起的各種病害嚴(yán)重制約其規(guī)模化養(yǎng)殖。魚類消化道是病原入侵機(jī)體的門戶之一，而腸道內(nèi)覆蓋在腸黏膜上的正常菌群是腸道防御外源致病菌入侵的天然屏障[1]。腸道中微生物的種類、數(shù)量等會(huì)隨著魚類的生長階段、生理狀態(tài)、生活環(huán)境及餌料組成等變化而處于動(dòng)態(tài)變化之中[2-4]。一般情況下，魚類腸道內(nèi)條件致病菌數(shù)量最多，益生菌次之，致病菌最少，細(xì)菌的種類及數(shù)量在一定程度上影響魚類腸道健康甚至機(jī)體健康。當(dāng)外界條件(水質(zhì)、餌料等)改變時(shí)，可能引起魚類不同程度的應(yīng)激反應(yīng)，腸道內(nèi)的條件致病菌異常生長，由共棲菌轉(zhuǎn)為致病菌，導(dǎo)致菌群失調(diào)甚至爆發(fā)疾病，毒害魚體健康[5,6]。

抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)是一類在生物體內(nèi)廣泛存在，具有抗菌作用的小分子多肽的總稱，包括天蠶素(cecropins)、防御素(defensins)、蛙皮素(magainins)、蜂毒素(melitins)和細(xì)菌素(bacteriocin)等不同類型?？咕淖鳛闄C(jī)體天然免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分，對細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲、腫瘤細(xì)胞等均具有抑制作用，同時(shí)對生物體的自身細(xì)胞無破壞性，無免疫原性，是生物體用來抵制病原微生物入侵的重要屏障[7,8]。體內(nèi)和體外抑菌試驗(yàn)均表明，抗菌肽對常見的多種病原菌均具有抑制作用，能顯著降低病原菌的數(shù)量，維持養(yǎng)殖水環(huán)境和腸道的微生態(tài)平衡[9]。

目前已用于魚類飼料添加劑的抗菌肽包括天蠶素抗菌肽、Surfactin抗菌肽以及水產(chǎn)動(dòng)物重組抗菌肽等。凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)[10]、中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)[11]、鯉(Cyprinuscarpio)[12]、羅非魚(Oreochromis)[13-16]、花鱸(Lateolabraxmaculatus)[17]、黑鯛(Sparusmacrocephlus)[18]、石斑魚(Epinephelus)[19,20]等水產(chǎn)動(dòng)物攝食抗菌肽可提高其生長性能、抗氧化能力和免疫能力。本實(shí)驗(yàn)在黃鱔餌料中添加不同水平的抗菌肽(基因工程產(chǎn)品)，通過研究其對黃鱔腸道好氧和兼性厭氧細(xì)菌種類、數(shù)量的影響，為黃鱔養(yǎng)殖和病害防治提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)用黃鱔，來自長江大學(xué)黃鱔養(yǎng)殖基地。暫養(yǎng)兩周后，將體格健壯，均重為(30±5)g的黃鱔隨機(jī)分為5組(對照組、組Ⅰ、組Ⅱ、組Ⅲ、組Ⅳ)，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)60尾。從2018年7月20日—9月28日每天18 ∶00投喂一次，對照組投喂基礎(chǔ)餌料，試驗(yàn)組分別投喂基礎(chǔ)餌料+200 mg/kg抗菌肽、基礎(chǔ)餌料+400 mg/kg抗菌肽、基礎(chǔ)餌料+600 mg/kg抗菌肽、基礎(chǔ)餌料+800 mg/kg抗菌肽，日投餌量占黃鱔體重7%～11%?；A(chǔ)餌料為70%冰蚯蚓+30%黃鱔顆粒飼料，抗菌肽為深圳市圣西馬生物技術(shù)有限公司提供，商品名：太輕松W。

1.2 樣品采集及計(jì)數(shù)

試驗(yàn)結(jié)束禁食后每組取3尾黃鱔，先用蒸餾水沖洗魚體表面，拭干，再用酒精棉球擦拭魚體表面消毒。在超凈工作臺(tái)內(nèi)用滅菌解剖工具打開試驗(yàn)魚腹腔取出腸道，用磷酸鹽緩沖液PBS pH=7.2沖洗腸道去除腸道內(nèi)容物。將每組所取的3尾黃鱔的腸道混合，冰浴中勻漿，稱量混合勻漿液0.5 g，加入4.5 mL滅菌生理鹽水，制成腸道原液，然后進(jìn)行梯度稀釋至10-7。取10-5、10-6、10-7三個(gè)梯度的稀釋液各100 μL，涂布于營養(yǎng)瓊脂平板，每個(gè)梯度做3個(gè)平行，然后將涂布好的平板置于28 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。選取細(xì)菌生長疏密適當(dāng)，菌落清晰，分散良好并且菌落數(shù)在30～300個(gè)的平板計(jì)數(shù)。將菌懸液濃度CFU/mL換算成每克腸道所含細(xì)菌的數(shù)量CFU/g，用IBM SPSS Statistics進(jìn)行單因素方差分析。

1.3 腸道細(xì)菌鑒定

觀察記錄平板上的菌落特征，隨機(jī)挑取50個(gè)左右單菌落作為待測菌株，純化后接種在營養(yǎng)斜面上，28 ℃培養(yǎng)24 h后，置于4 ℃?zhèn)溆?。針對腸道好氧和兼性厭氧細(xì)菌參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》(第八版)[21]按照以下步驟進(jìn)行鑒定：①待測菌株進(jìn)行革蘭氏染色，結(jié)合鏡檢將細(xì)菌分成革蘭氏陽性球菌、陽性桿菌、陰性球菌及陰性桿菌；②用玻璃棒蘸取菌苔與玻片上3% H2O2反應(yīng)，立即產(chǎn)生氣泡者為陽性，反之為陰性；③用1%四甲基對苯二胺試劑濕潤的濾紙蘸取菌苔，觀察顏色變化，10 s內(nèi)出現(xiàn)紅色者陽性，反之為陰性；④穿刺接種半固體營養(yǎng)瓊脂進(jìn)行細(xì)菌動(dòng)力試驗(yàn)，培養(yǎng)后細(xì)菌在穿刺線周圍有擴(kuò)散生長者為陽性，反之為陰性；⑤將待測菌同時(shí)接種兩支HL(Hugh-Leifson)葡萄糖培養(yǎng)基，一支滴加無菌液體石蠟，培養(yǎng)后兩支培養(yǎng)基均無變化者為產(chǎn)堿型(-)，兩支培養(yǎng)基均產(chǎn)酸者為發(fā)酵型(F)，僅不加石蠟的培養(yǎng)基產(chǎn)酸者為氧化型(O)。

1.4 多樣性分析

根據(jù)菌株鑒定結(jié)果，以各類細(xì)菌所占比例及其多樣性指數(shù)評(píng)價(jià)不同抗菌肽添加水平對腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響。

計(jì)算公式：

各類細(xì)菌在菌群中所占比例：Pi=Ni/N；

Shannon-Wiener指數(shù)：H′=-∑PilnPi

Simpson指數(shù)：D=1-∑(Pi)2

式中，Pi為第i類細(xì)菌在菌群中所占比例，Ni為第i類細(xì)菌的個(gè)體數(shù)目，N是腸道中全部細(xì)菌種類的總個(gè)體數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 抗菌肽對腸道細(xì)菌總數(shù)的影響

采用平板菌落計(jì)數(shù)法對各組黃鱔腸道好氧和兼性厭氧菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果見表1。對照組細(xì)菌總數(shù)最多為(3.80±1.95)×107CFU/g，組Ⅲ細(xì)菌總數(shù)最少為(3.00±1.66)×107CFU/g，單因素方差分析表明各組腸道細(xì)菌總數(shù)無顯著性差異。

表1 飼料中添加抗菌肽對黃鱔腸道細(xì)菌總數(shù)的影響Tab.1 Effects of dietary antimicrobial peptide supplementation on the total number of intestinal microflora of M.albus 107 CFU/g

2.2 腸道菌群鑒定

對黃鱔各組隨機(jī)分離純化50個(gè)左右菌落進(jìn)行鑒定，如圖1所示，各組黃鱔腸道中鑒定出好氧和兼性厭氧菌共14類。通過革蘭氏染色結(jié)合鏡檢，將分離純化菌株分成陽性球菌、陽性桿菌、陰性球菌和陰性桿菌。對革蘭氏陽性球菌進(jìn)行動(dòng)力試驗(yàn)，陽性者為動(dòng)性球菌屬(Planococcus)。陽性球菌無動(dòng)力細(xì)菌進(jìn)行接觸酶試驗(yàn)，陰性者為鏈球菌屬(Streptococcus)；接觸酶陽性者進(jìn)行氧化發(fā)酵試驗(yàn)，發(fā)酵型為葡萄球菌屬(Staphylococcus)，其他為微球菌屬(Micrococcus)。革蘭氏染色陽性桿菌進(jìn)行動(dòng)力試驗(yàn)，無動(dòng)力者為棒桿菌屬(Corynebacterium)。陽性桿菌中有動(dòng)力細(xì)菌進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)，陽性者為芽孢桿菌屬(Bacillus)，陰性者為乳桿菌屬(Lactobacillus)。革蘭氏染色為陰性球菌者為奈瑟菌屬(Neisseria)。而革蘭氏染色陰性桿菌是待測菌株中最多的類型。發(fā)酵型陰性桿菌進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)，陽性者為氣單胞菌屬(Aeromonas)，陰性者為腸桿菌科(Enterobacteriaceae)。其他陰性桿菌進(jìn)行動(dòng)力試驗(yàn)，有運(yùn)動(dòng)性且為氧化型者為假單胞菌屬(Pseudomonas)，有運(yùn)動(dòng)性為產(chǎn)堿型者為產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes)；無運(yùn)動(dòng)性且氧化酶陽性者為黃桿菌屬(Flavobacterium)，陰性者為不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)。

圖1 腸道好氧及兼性厭氧菌鑒定結(jié)果Fig.1 Identification of isolated aerobic and facultative anaerobic strains from the intestinal

2.3 抗菌肽對腸道菌群組成的影響

各組分離純化的細(xì)菌的類型及各類細(xì)菌所占的比例如圖2。從圖中可見，對照組黃鱔腸道中以腸桿菌科(未分屬)、氣單胞菌屬、假單胞菌屬、黃桿菌屬4類革蘭氏陰性菌為主，其含量分別為23.2%、14.3%、12.5%、14.3%，共占所有細(xì)菌的64.3%。與對照組相比，飼料中添加不同含量的抗菌肽均能降低腸道中腸桿菌科和黃桿菌屬細(xì)菌所占比例。腸桿菌科細(xì)菌在組Ⅰ～組Ⅳ中所占比例分別為18.5%、20.8%、17.6%、22.0%，黃桿菌屬細(xì)菌的所占比例分別為9.3%、9.4%、2.0%、4.0%。而氣單胞菌屬細(xì)菌在組Ⅰ和組Ⅳ中所占比例高于對照組，在組Ⅱ中所占比例最低為11.3%；假單胞菌僅在組Ⅲ中的所占比例低于對照組，為11.8%。腸道中除革蘭氏陰性桿菌外，革蘭氏陽性芽孢桿菌也在各組中所占比例較高，在對照組和各處理組中均為10%左右；而另一種革蘭氏陽性桿菌乳酸桿菌的含量在抗菌肽添加組的含量均比對照組高，在組Ⅲ中最高為13.7%。除桿菌之外，各組還分離鑒定出部分球菌，各類球菌在腸道中所占比例在10.7%～16.7%之間，在組Ⅰ中含量最高，在對照組中最低。

圖2 飼料中添加抗菌肽對黃鱔腸道菌群組成的影響Fig.2 Effects of dietary antimicrobial peptide supplementation on the proportion of intestinal microflora of M.albus

黃鱔腸道中的優(yōu)勢菌群中革蘭氏陰性桿菌腸桿菌科、氣單胞菌屬、假單胞菌屬、黃桿菌屬細(xì)菌是魚類的主要條件致病菌，而革蘭氏陽性桿菌芽孢桿菌屬和乳酸桿菌屬細(xì)菌則是腸道中的主要益生菌。對其腸道中主要條件病原菌(腸桿菌科、黃桿菌屬、假單胞菌屬、氣單胞菌屬4類細(xì)菌所占比例總和)和益生菌(芽孢桿菌屬和乳酸桿菌屬2類細(xì)菌所占比例總和)進(jìn)行分類比較，如圖3所示：隨著抗菌肽添加濃度的升高，腸道中條件病原菌的含量呈現(xiàn)先降后升的趨勢，而益生菌則呈現(xiàn)先升后降的趨勢。其中組Ⅲ(600 mg/kg)條件病原菌所占最低，比對照組64.3%下降10.2%；而益生菌所占比例最高，比對照組高出11.0%。隨著抗菌肽的添加量達(dá)到800 mg/kg時(shí)，黃鱔腸道中的條件病原菌的比例表現(xiàn)出上升的趨勢，其所占比例達(dá)到58.0%，高于組Ⅲ和組Ⅱ(400 mg/kg)中的比例；同時(shí)其益生菌的比例出現(xiàn)下降的趨勢，由組Ⅲ中23.5%的比例下降到16.0%。

圖3 飼料中添加抗菌肽對黃鱔腸道優(yōu)勢菌群組成的影響Fig.3 Effects of dietary antimicrobial peptide supplementation on the proportion of dominant intestinal microflora of M.albus

2.4 抗菌肽對腸道菌群多樣性的影響

抗菌肽不同添加水平處理組的腸道菌群多樣性顯示(圖4)：隨著抗菌肽添加量的增加，Shammon-Wiener多樣性指數(shù)(H′)和Simpson多樣性指數(shù)(D)均呈現(xiàn)出先升后降的趨勢。組Ⅰ、組Ⅱ、組Ⅲ的細(xì)菌多樣性指數(shù)均顯著高于對照組和組Ⅳ。其中組Ⅲ的多樣性指數(shù)最高，分別為H′ 2.35、D0.89。對照組腸道菌群多樣性指數(shù)最低，分別為H′ 2.25、D0.87。

圖4 飼料中添加抗菌肽對黃鱔腸道菌群多樣性的影響Fig.4 Effects of dietary antimicrobial peptide supplementation on the diversity of intestinal microflora of M.albus

3 討論

動(dòng)物腸道菌群是按一定的比例組合，菌群間互相制約，互相依存，構(gòu)建的一個(gè)復(fù)雜的微生物生態(tài)系統(tǒng)[1]?？咕木哂袕V譜抗菌性，體內(nèi)外試驗(yàn)表明其對常見的多種病原菌具有抑制作用[22]。如飼料中添加基因工程抗菌肽Pc-pchc能降低黑鯛腸道內(nèi)梭菌綱的相對豐度[18]，天蠶素抗菌肽能降低斜帶石斑魚腸道內(nèi)條件致病菌弧菌的數(shù)量[19]，在一定程度上抑制腸道有害菌。翟少偉等[15]研究表明飼料中添加不同含量Surfactin抗菌肽對吉富羅非魚腸道可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)無顯著性影響；蘇保元[19]研究表明飼料中添加天蠶素抗菌肽對斜帶石斑魚腸道細(xì)菌總數(shù)無顯著影響；本研究同樣發(fā)現(xiàn)飼料中添加抗菌肽對黃鱔腸道細(xì)菌總數(shù)無顯著性影響。相較于對腸道細(xì)菌總數(shù)的影響，抗菌肽作為飼料添加劑進(jìn)入腸道可塑造和控制腸道菌群的組成，在降低腸道病原菌的同時(shí)增加益生菌的數(shù)量。如Surfactin抗菌肽能降低吉富羅非魚腸道致病性大腸桿菌[15]、斜帶石斑魚腸道中條件致病菌弧菌的數(shù)量[19]，同時(shí)增加乳酸菌的數(shù)量。本研究結(jié)果表明飼料中添加600 mg/kg基因工程抗菌肽，黃鱔腸道中腸桿菌科、黃桿菌屬、氣單胞菌屬和假單胞菌屬4類條件致病菌合占比例最低為45.1%，比對照組下降10.2%；而腸道益生菌乳桿菌屬所占比例由對照組的1.8%達(dá)到13.7%，且各抗菌肽添加組乳桿菌屬占比均比對照組高。腸道中致病菌和益生菌數(shù)量的變化表現(xiàn)為：致病菌數(shù)量的降低增加了腸道正常菌群和益生菌的營養(yǎng)物質(zhì)和生存繁殖空間，從而改善腸道微環(huán)境。

腸道菌群多樣性的差異與飼料成分密切相關(guān)。郝耀彤等[23]對草魚飼喂蘇丹草，微生物多樣性指數(shù)顯示后腸樣品Shannon指數(shù)H′一般不低于4.25，而前、中腸樣品H′均未超過 4.25；而飼喂人工飼養(yǎng)草魚后腸多樣性指數(shù)不低于4.95。本研究中隨著抗菌肽添加量的增加，黃鱔腸道菌群Shammon-Wiener多樣性指數(shù)和Simpson多樣性指數(shù)均呈現(xiàn)出先升后降的趨勢。組Ⅰ、組Ⅱ、組Ⅲ的多樣性指數(shù)均顯著高于對照組和組Ⅳ。可見，在飼料中適量添加抗菌肽能提高腸道菌群的多樣性水平，改善腸道的微環(huán)境。 本研究同樣發(fā)現(xiàn)，在抗菌肽添加劑量達(dá)到800 mg/kg時(shí)，腸桿菌科、黃桿菌屬、氣單胞菌屬和假單胞菌屬等條件致病菌所占比例達(dá)到58.0%，超過了組Ⅱ(400 mg/kg，56.6%)和組Ⅲ(600 mg/kg，45.1%)中這4類細(xì)菌所占的比例；而乳桿菌屬所占比例為6.0%，雖然高于對照組1.8%和組Ⅰ(200 mg/kg)的3.7%，但是低于組Ⅱ的7.5%和組Ⅲ的13.7%。同時(shí)抗菌肽添加劑量達(dá)到800 mg/kg時(shí)，多樣性指數(shù)H′從2.35下降到2.28，D從0.89下降到0.87?？梢?，飼料中添加抗菌肽對腸道有益菌和致病菌的數(shù)量及菌群多樣性水平的調(diào)控與抗菌肽的劑量有關(guān)?？咕牡姆N類和飼喂魚類都影響抗菌肽在飼料中的添加量，如Surfactin抗菌肽在吉富羅非魚中的添加量超過50 mg/kg[15]，在花鰻鱺中超過25 mg /kg[24]，在斜帶石斑魚中超過100 mg/kg[25]；家蠅抗菌肽在黃顙魚中超過0.2%[26]，重組中國明對蝦抗菌肽在羅非魚中超過50 mg/kg[27]，天蠶素抗菌肽在建鯉中超過600 mg/kg時(shí)[28]，對魚類的生長有一定的抑制作用。

綜上所述，黃鱔基礎(chǔ)飼料中添加適量的抗菌肽具有調(diào)節(jié)黃鱔腸道菌群結(jié)構(gòu)的效果。本試驗(yàn)的基礎(chǔ)飼料中添加600 mg/kg抗菌肽投喂黃鱔后，較200 mg/kg和400 mg/kg劑量添加組其腸道中條件致病菌的組成比例最低，有益菌的組成比例最高，其菌群多樣性水平也最高。但抗菌肽添加劑量達(dá)到800 mg/kg時(shí)，其相關(guān)指標(biāo)如條件致病菌的組成比例有所增加，有益菌的組成比例下降，菌群多樣性水平下降。因此，本試驗(yàn)條件下，基礎(chǔ)飼料(70%冰蚯蚓+30%黃鱔顆粒飼料)中添加600 mg/kg抗菌肽飼喂黃鱔后，對其腸道菌群結(jié)構(gòu)有較好的改善作用。