陳德舉,強(qiáng) 俊,陶易凡,包景文,李紅霞,,朱昊俊,徐 跑,

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇無錫214081；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214081)

河豚(Takifugurubripes)，又稱河鲀，因其味鮮而廣受人們喜愛。目前，人工養(yǎng)殖的河豚一般低毒或無毒，而野生河豚的內(nèi)臟、卵巢、血液等組織通常含有大量的河豚毒素(tetrodotoxin，TTX)，基于此，一般選擇野生河豚的卵巢來提取TTX，從而會產(chǎn)生大量的卵巢廢棄物，而這些廢棄物仍含有較多的營養(yǎng)素、微量元素以及少量的TTX未被利用。已有報(bào)道顯示，河豚卵巢提取物可顯著增加小鼠脾臟和胸腺的重量，提高小鼠腹腔吞噬細(xì)胞吞噬率[1]。除此之外，在一定的劑量范圍內(nèi)，河豚卵提取物還可提高小鼠的非特異性免疫[2]。河豚卵中除含有豐富的蛋白質(zhì)和脂肪外，還含有微量的河豚毒素、糖類以及維生素、溶菌酶、微量元素等生物活性物質(zhì)[3]。研究表明，河豚毒素可替代廣譜抗生素，抑制革蘭氏菌陽性生長[4]。河豚毒素還具有抗腫瘤作用，其抗腫瘤活性顯著高于珍珠貝茹多糖[5]。此外，與其它昆蟲等動物蛋白源相比，河豚卵處理物還具有較高的鈣磷比，可用來調(diào)配膳食及飼料中的鈣磷含量[3]。

目前對羅非魚飼料添加物較多，中草藥飼料添加劑因其毒副作用小、不易產(chǎn)生抗藥性而備受關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，中草藥等植物性添加劑的有效成分極為復(fù)雜，適當(dāng)?shù)奶砑訉α_非魚的生長[6]、改善品質(zhì)[7]以及免疫調(diào)節(jié)[8]具有促進(jìn)作用。然而，植物性添加劑的研發(fā)并不能很好地解決羅非魚鏈球菌病以及健康養(yǎng)殖的問題。與植物性添加劑相比，羅非魚飼料的動物源性添加物研究顯得相對空缺?；诖?，本實(shí)驗(yàn)選用去毒后的野生橫紋東方鲀卵巢廢棄物，經(jīng)真空冷凍干燥后獲得處理物,并以吉富羅非魚為研究對象，均添加河豚卵處理物的飼料，研究吉富羅非魚生長性能和血液生化指標(biāo)的差異與變化，同時進(jìn)行海豚鏈球菌感染實(shí)驗(yàn)，以期為動物源飼料添加劑在羅非魚飼料中的研究以及羅非魚健康養(yǎng)殖提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 河豚卵處理物的獲取與飼料制備

選取野生的去除河豚毒素后的橫紋東方鲀卵巢廢棄物，用真空冷凍干燥機(jī)干燥36 h以上，超微粉碎后過80目篩，獲得河豚卵處理物。經(jīng)測定本實(shí)驗(yàn)所用河豚卵處理物中，蛋白含量占60.6%～75.6%，粗脂肪含量為17.2%～32.1%，其不飽和脂肪酸占總脂肪酸的60%以上，此外，河豚卵處理物還含有一定量的α-亞麻酸(α-Linolenic acid，ALA)，亞油酸，以及較高的n-3/n-6不飽和脂肪酸(見表1)。

表1 河豚卵處理物脂肪酸含量Tab.1 Total fatty acids of extract powder from puffer fish ovaries %

制備飼料時，充分混勻各種飼料原料，依次添加河豚卵處理物量如下：0、0.2%、0.4%、0.8%、1.6%、3.2%、6.4%，制備7組飼料S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7，每組實(shí)驗(yàn)飼料的TTX含量依次為0、2.5、5.5、11.8、23.9、45.6和95.2 μg/kg，飼料水分約為12%，干燥后保存在-20 ℃?zhèn)溆?。各組飼料組成和營養(yǎng)成分分析見表2。

表2 飼料組成和營養(yǎng)成分分析Tab.2 The composition and nutrients analysis of feed %

1.2 實(shí)驗(yàn)用魚與飼養(yǎng)管理

實(shí)驗(yàn)魚選自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心無錫宜興基地。實(shí)驗(yàn)開始前，將魚放入室內(nèi)450 L循環(huán)養(yǎng)殖桶中，在(28±1)℃水溫下暫養(yǎng)15 d。在此期間，投喂市售商品膨化飼料(粗蛋白質(zhì)28.0%，粗脂質(zhì)6.0%)(寧波天邦股份有限公司)。挑選初始體重為(0.66±0.01)g、體質(zhì)健壯、無病無傷的吉富羅非魚用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)1個對照組和6個實(shí)驗(yàn)組，各組依次投喂S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7組飼料，每組設(shè)置3個重復(fù)，每個重復(fù)25尾魚，分別放入21個450 L循環(huán)養(yǎng)殖桶，桶內(nèi)含水約360 L。實(shí)驗(yàn)期間，每天兩次飽食投喂(8 ∶00和16 ∶00)，并在魚類攝食完畢后清除桶底糞便，每3 d換水1/3，使水體溶氧保持在6 mg/L以上，水溫控制在(28±1)℃，pH值控制在7.4～7.8，氨氮含量<0.1 mg/L。養(yǎng)殖周期為8周。

1.3 樣品采集與處理

采樣前，吉富羅非魚禁食24 h。用濃度為200 mg/L的MS-222預(yù)先麻醉，記錄每桶魚的尾數(shù)并且稱重，每桶隨機(jī)取4尾魚抽取血液，吸取20 μL用于血常規(guī)檢測，剩余血液經(jīng)4 ℃ 5 000 r/min離心15 min收集血清，放入-40 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。采血后進(jìn)行解剖，取肝臟組織稱重后，用生理鹽水漂洗、吸干其表面水分后再放入-40 ℃冰箱保存；同時取剩余內(nèi)臟團(tuán)并稱重。

1.4 指標(biāo)測定及計(jì)算

1.4.1 生長指標(biāo)

成活率(SR)、體增重(WG) 、特定生長率(SGR)、飼料轉(zhuǎn)化率(FCR)、肝臟比(HSI)和臟體比(VSI)。計(jì)算公式如下：

SR=100%×Nt/N0；

WG=Wt-W0;

FCR=Wf/(Wt-W0)；

SGR=(lnWt-lnW0)/d×100%；

HSI=100%×Wl/Wt；

VSI=Wv/Wt×100%

式中，Nt為終末魚尾數(shù)；N0為初始魚尾數(shù)；Wt為終末魚體重(g)；W0初始魚體重(g)；Wf為尾均攝食飼料總量(g)；d為養(yǎng)殖天數(shù)；Wv為內(nèi)臟重；Wl為肝臟重。

1.4.2 血常規(guī)指標(biāo)

根據(jù)Qiang等[9]描述的方法使用血細(xì)胞分析儀(Mindray，bc-5300，Shenzhen，China)對血常規(guī)指標(biāo)包括白細(xì)胞(WBC)、紅細(xì)胞(RBC)、血紅蛋白(HGB)以及紅細(xì)胞比容(Hct)進(jìn)行計(jì)數(shù)，所有試劑購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司(深圳)。

1.4.3 血液生化指標(biāo)

血清中總蛋白(TP，雙縮脲法)、甘油三酯(TG，氧化酶法)、總膽固醇(TC，氧化酶法)、葡萄糖(己糖激酶法)的濃度以及谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT，IFFT酶比色法)的活性使用自動生化分析儀(Mindray，BS-400，Shenzhen，China)測定，所有試劑盒均購自于深圳邁瑞有限公司(深圳，中國)。血清溶菌酶(LZM)活性、皮質(zhì)醇(COR)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細(xì)胞介素1(IL-1β)和γ-干擾素(IFN-γ)的濃度參照試劑盒說明書進(jìn)行測定，試劑盒購自上海朗頓生物科技有限公司(上海)。

1.5 海豚鏈球菌感染實(shí)驗(yàn)

1.5.1 供試菌株及來源及培養(yǎng)基的制備

供試海豚鏈球菌菌株由廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院提供，從患病吉富羅非魚上分離鑒定而來。本次實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基為腦心浸液液體培養(yǎng)基，按培養(yǎng)基說明書配置1 L溶液，經(jīng)121 ℃滅菌15 min后分裝，4 ℃冷藏備用。

1.5.2 海豚鏈球菌菌液的制備

將海豚鏈球菌接種于已制備好的無菌腦心浸液液體培養(yǎng)基中，放入搖床，過夜振蕩培養(yǎng)(37 ℃,180 r/min)。細(xì)菌濃度通過平板計(jì)數(shù)達(dá)到1010～1011數(shù)量級后，離心收集細(xì)菌，用0.85% NaCl重懸，稀釋濃度至5×106～5×108CFU/mL，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5.3 海豚鏈球菌感染實(shí)驗(yàn)

根據(jù)文獻(xiàn)[10,11]的方法，配制5×106、1×107、5×107、1×108、5×108CFU/mL 5個海豚鏈球菌液濃度水平，隨機(jī)選取60尾與實(shí)驗(yàn)魚同等規(guī)格的魚進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，選擇注射后使吉富羅非魚接近半數(shù)致死(96 h)的菌液濃度(5×107CFU/mL)用于正式實(shí)驗(yàn)。養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將剩余吉富羅非魚繼續(xù)暫養(yǎng)10 d，正常投喂，以減少采樣應(yīng)激。正式實(shí)驗(yàn)時，按每100 g魚體重/0.5 mL注射菌液(5×107CFU/mL)。實(shí)驗(yàn)期間正常投喂，水體溶氧保持在6 mg/L以上，水溫控制在(28±1)℃，pH值控制在7.4～7.8，氨氮含量<0.1 mg/L。每天觀察吉富羅非魚活動情況，及時撈出死魚，記錄24、48、96、192 h吉富羅非魚死亡數(shù)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean ± SE，n=12)表示。使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件中單因素方差分析和Duncan’s多重比較法對試驗(yàn)結(jié)果的差異顯著性進(jìn)行分析處理，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 河豚卵處理物對吉富羅非魚生長性能的影響

由表3可知，養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)開始前七組羅非魚的初始體重?zé)o顯著差異，飼喂8周后，0.2%河豚卵處理物添加組羅非魚的末體重(FBW)、WG和SGR顯著高于對照組和其他河豚卵處理物添加組，且對照組羅非魚FBW、WG和SGR與0.4%添加組無顯著差異，但均顯著高于其他添加組。HSI和VSI均在0.8%添加組達(dá)到最高，但各組間HSI無顯著差異，0.8%河豚卵處理物添加組羅非魚的VSI顯著高于其他組，而隨著河豚卵處理物添加水平提高，飼料轉(zhuǎn)化率(FCR)呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。

表3 河豚卵處理物對吉富羅非魚生長性能的影響Tab.3 Effects of extract powder from puffer fish ovaries on growth performance of GIFT

2.2 河豚卵處理物對吉富羅非魚血液生化的影響

飼喂8周后，不同水平的河豚卵處理物對吉富羅非魚血液指標(biāo)影響的結(jié)果見表4。隨著河豚卵處理物添加水平提高，河豚卵處理物添加組羅非魚血液中RBC、HGB、HCT的含量逐漸降低，且與對照組相比，HGB和HCT的值顯著降低，而WBC的含量逐漸升高，且1.6%、3.2%以及6.4%添加組羅非魚血液中WBC含量顯著高于對照組。

表4 不同添加水平的河豚卵處理物對吉富羅非魚血液生化指標(biāo)的影響Tab.4 Effects of different levels of extract powder from puffer fish ovaries on biochemical blood indicators of GIFT

2.3 河豚卵處理物對吉富羅非魚血清生化指標(biāo)的影響

飼喂8周后，對吉富羅非魚血清生化指標(biāo)影響的結(jié)果見表5。羅非魚血清中TP的含量隨著河豚卵處理物添加水平的增加而下降，對照組羅非魚血清中TP、GLU的含量顯著高于添加組；而TC和TG的含量隨著河豚卵處理物添加濃度水平的增加而下降，且TC含量在6個實(shí)驗(yàn)組間無顯著差異；對照組羅非魚血清中AST、ALT的活性與0.2%、0.4%添加組無顯著差異，但顯著低于0.8%、1.6%、3.2%以及6.4%添加組。隨著河豚卵處理物添加水平的增加，與對照組相比，河豚卵處理物添加組血清溶菌酶(LZM)含量逐漸增加，但無顯著差異。

表5 不同添加水平的河豚卵處理物對吉富羅非魚血清生化指標(biāo)的影響Tab.5 Effects of different levels of extract powder from puffer fish ovaries on serum biochemistry of GIFT

2.4 河豚卵處理物對吉富羅非魚血清皮質(zhì)醇及部分促炎因子的影響

由圖1可知，飼喂添加河豚卵處理物飼料后，與對照組相比，河豚卵處理物添加組羅非魚血清皮質(zhì)醇(COR)、血清腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細(xì)胞介素1(IL-1β)和γ-干擾素(IFN-γ)的濃度均呈先上升后趨于穩(wěn)定的趨勢。與對照組相比，6.4%河豚卵處理物添加組羅非魚血清COR、TNF-α、IL-1β和IFN-γ的濃度均顯著增加。

圖1 不同添加水平的河豚卵處理物對吉富羅非魚COR、TNF-α、IL-1β和IFN-γ的影響(n=12)

2.5 河豚卵處理物對吉富羅非魚感染海豚鏈球菌后存活率的影響

不同添加水平的河豚卵處理物對吉富羅非魚感染海豚鏈球菌后存活率的影響結(jié)果見圖2。羅非魚在感染海豚鏈球菌24 h內(nèi)均未出現(xiàn)死亡；感染48～96 h，對照組羅非魚累計(jì)存活率最低，與河豚卵處理物添加組差異顯著；感染192 h后，6.4%河豚卵處理物添加組羅非魚累計(jì)存活率達(dá)到95.2%，對照組累計(jì)存活率為43.3%，各河豚卵處理物添加組羅非魚累計(jì)存活率顯著高于對照組。

圖2 不同添加水平的河豚卵處理物對吉富羅非魚感染海豚鏈球菌累計(jì)存活率的影響Fig.2 Changes of cumulative survival rate after GIFT challenged with S.iniae under different extract powder from puffer fish ovaries levels

3 討論

3.1 河豚卵處理物對吉富羅非魚生長性能的影響

趙榮興等[12]研究發(fā)現(xiàn)向飼料中添加河豚毒素

飼養(yǎng)河豚不僅能提高魚體的免疫力，降低魚病的發(fā)生率，而且添加河豚毒素的飼料可以作為河豚生長的營養(yǎng)飼料。本實(shí)驗(yàn)中河豚卵處理物雖經(jīng)過脫毒處理，但其內(nèi)仍存在一定濃度的TTX。飼料中微量的TTX可能在對羅非魚免疫能力增強(qiáng)，同時微量的外源毒素脅迫能更好調(diào)動魚體代謝與抗應(yīng)激能力，提高魚體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收從而促進(jìn)生長。但隨著河豚卵處理物濃度的增高，羅非魚的生長也呈現(xiàn)出明顯的抑制作用。HSI和VSI是可用來說明魚體健康狀況的兩個指標(biāo)[13]，在0.8%河豚卵處理物添加組中，HSI和VSI達(dá)最高值。因此我們推測隨著河豚卵處理物添加量增加，可能會抑制羅非魚肝、內(nèi)臟的生長發(fā)育，并且顯著抑制羅非魚的WG。因此我們推測，微量添加的河豚卵處理物(0.2%)對吉富羅非魚的生長有一定的促進(jìn)作用。

3.2 河豚卵處理物對吉富羅非魚血液生化的影響

魚的血液組成受新陳代謝、營養(yǎng)狀況和疾病的影響[14]。血液作為免疫系統(tǒng)的重要組成部分，血液生化指標(biāo)的改變也是衡量生物體健康程度的一個重要標(biāo)準(zhǔn)[15,16]。RBC在血液中承擔(dān)著氧氣運(yùn)輸?shù)淖饔肹17]。RBC、WBC、HGB和HCT等血液參數(shù)水平的變化反映個體的健康狀況[18]。RBC影響氧氣和二氧化碳的輸送。HGB是一種在魚體內(nèi)攜帶氧氣的蛋白質(zhì)，因此其濃度與RBC計(jì)數(shù)密切相關(guān)[19]。本研究中，對照組RBC和HCT值最高，隨著河豚卵處理物添加水平的提高，呈逐漸下降的趨勢。與此同時，HGB的濃度隨著河豚卵巢處理物添加水平的提高也呈下降趨勢。強(qiáng)俊等[10]推測，在最適溫度下，食物攝入量增加，代謝能力提高，導(dǎo)致氧氣需求增加，RBC含量增加。然而，本實(shí)驗(yàn)中隨著河豚卵處理物添加水平的提高，高添加組中較高的TTX含量造成羅非魚攝食量減少，代謝能力降低。可能對氧氣需求減少，導(dǎo)致RBC含量減少。HGB和WBC在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮作用。WBC數(shù)的變化可用于檢測魚類的疾病或傷害[20]。在本研究中，WBC含量逐漸升高，這與強(qiáng)俊等[10]及Slatea等[21]人的觀察結(jié)果一致。WBC含量增多表明河豚卵處理物可能提高魚體免疫力。

3.3 河豚卵處理物對吉富羅非魚血清生化的影響

血清GLU、TP、ALT和TC等指標(biāo)是一些具有代表性的血清生化指標(biāo)，通常會被用來觀察應(yīng)激對魚體的影響[22]。研究表明，TG和TC含量反映了脂質(zhì)的吸收情況[23]。在本研究中，對照組羅非魚的TC和TG含量最高，說明高添加水平的河豚卵處理物可能有利于羅非魚脂肪的吸收，也可能對羅非魚的脂質(zhì)代謝有一定的促進(jìn)作用。肝臟中的多種酶活性的變化可以很好地反映魚體的代謝與功能的變化[24]，Senior[20]研究發(fā)現(xiàn)血清中ALT的變化能及時反映肝臟的損傷情況。此外，血清TP維持著魚體血漿滲透壓以及pH的平衡，并且在魚體中參與營養(yǎng)運(yùn)輸、凝血、免疫和能量供應(yīng)等活動[25]。河豚卵處理物添加組的甘油三酯含量下降，可能是因?yàn)轸~體需要抵抗TTX的應(yīng)激效應(yīng)，導(dǎo)致脂肪酸氧化供能需求增加，進(jìn)一步導(dǎo)致脂質(zhì)分解供能增加[26]。一些研究指出，TG含量的增加表明肝臟中的脂肪積累，并導(dǎo)致脂肪肝或肝臟肥大[27]。另一方面，Griffith[28]認(rèn)為血清TC與TP的變化是密切相關(guān)的，TC是血液中各種膽固醇的集合，肝臟作為膽固醇最為重要的調(diào)節(jié)器官[29]，在飼料中添加河豚卵處理物條件下，TC的顯著變化可能反映了肝臟功能的異常與損傷。結(jié)合羅非魚諸多血清指標(biāo)下降的情況，這可能是由于羅非魚無法適應(yīng)高水平河豚卵處理物而產(chǎn)生的變化。

AST、ALT主要分布于肝細(xì)胞中，當(dāng)肝細(xì)胞受損傷時，ALT和AST在血清中的含量升高，其變化趨勢與肝細(xì)胞受損程度相一致[30,31]。本試驗(yàn)中，隨著河豚卵處理物添加水平的提高，ALT、AST急劇上升，也表明添加高水平河豚卵處理物對羅非魚肝臟有損傷，使羅非魚生長性能降低，思考其原因可能是因?yàn)楦咚胶与嗦烟幚砦锝M中含有較高濃度的TTX，超過一定濃度的TTX造成魚體肝臟的損傷，這與生長指標(biāo)中所呈現(xiàn)的現(xiàn)象相互印證。但添加水平小于0.4%時，ALT、AST較對照組有下降，說明飼料中添加0.2%和0.4%河豚卵處理物可能對羅非魚肝臟有一定保護(hù)作用。

3.4 河豚卵處理物對吉富羅非魚感染存活率的影響

感染實(shí)驗(yàn)中我們采用5×107CFU/mL濃度的海豚鏈球菌菌液對吉富羅非魚進(jìn)行腹腔注射，6.4%河豚卵處理物添加組累計(jì)存活率顯著高于對照組與其他河豚卵處理物添加組，這與沈凡等[32]研究結(jié)果有所差異。6.4%河豚卵處理物組末體重(33.03 g)顯著低于對照組末體重(72.15 g)，我們推測規(guī)格上的較大差異是造成累計(jì)存活率差異的原因之一。同時，本研究中河豚卵處理物添加組吉富羅非魚WBC的數(shù)量明顯上升，TNF-α， IL-1β，以及IFN-γ等促炎因子的濃度均呈先上升后趨于穩(wěn)定的趨勢，河豚卵處理物實(shí)驗(yàn)組飼料中均含有一定濃度的TTX ,長期外源毒素脅迫可能激活了吉富羅非魚體內(nèi)的免疫防御系統(tǒng)，在面對海豚鏈球菌侵染時，使得吉富羅非魚具有較強(qiáng)的抵抗力。此外，溶菌酶是魚類的免疫系統(tǒng)的一種防御酶，它負(fù)責(zé)分解多種細(xì)菌的細(xì)胞壁，從而對魚體細(xì)菌感染提供一些保護(hù)[33]。相關(guān)研究報(bào)道，機(jī)體感染病原菌后，血液溶菌酶活性會出現(xiàn)增加[18]，或無顯著影響[34]的結(jié)果。在本研究中，隨著河豚卵處理物添加水平增加，血清溶菌酶活性升高，類似結(jié)論在其他研究中也有出現(xiàn)[35]。本研究中添加組羅非魚感染后存活率遠(yuǎn)高于對照組。因此，飼料中添加河豚卵處理物的可提高羅非魚抵抗海豚鏈球菌感染的能力，然而河豚卵處理物的添加引起的羅非魚免疫系統(tǒng)改變，對于其具體的作用機(jī)制尚未可知，需要進(jìn)一步的研究。