馬良驍，賈 睿

(1.湖北至正天辰生物科技有限公司，武漢 430070；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心， 江蘇無(wú)錫 214081)

近年來(lái)，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)?；?、集約化程度提高，魚(yú)類(lèi)肝臟疾病頻繁發(fā)生，如肝膽綜合征、化學(xué)性肝損傷以及脂肪性肝損傷，嚴(yán)重制約著魚(yú)類(lèi)健康養(yǎng)殖發(fā)展[1,2]。其中，以脂肪肝或脂肪性肝損傷為主要特征的肝臟疾病越來(lái)越受到研究者和生產(chǎn)者的關(guān)注。魚(yú)類(lèi)脂肪性肝病與肝臟脂肪代謝紊亂、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)以及肝細(xì)胞壞死有關(guān)[3,4]。水產(chǎn)養(yǎng)殖中，營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩、環(huán)境應(yīng)激、病原菌感染、基因突變等均可導(dǎo)致脂肪肝的發(fā)生[5]。脂肪肝的危害主要包括降低生長(zhǎng)、飼料利用率、免疫力、應(yīng)激耐受性和產(chǎn)品感官等，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和市場(chǎng)消費(fèi)者造成相當(dāng)大的負(fù)面影響[6]。

虎杖(Polygonumcuspidatum)為蓼科植物，為我國(guó)傳統(tǒng)中藥，其根莖含有多種藥理活性成分，如蒽醌類(lèi)、二苯乙烯類(lèi)、萘醌類(lèi)、黃酮類(lèi)等[7-9]。早期研究表明，虎杖提取物可有效抑制小鼠(Musmusculus)肝組織中甘油三酯(TG)和總膽固醇(TC)沉積，改善脂肪代謝[10]。除此之外，虎杖提取物還可提高小鼠抗氧化能力、抑制炎癥因子生成、緩解四氯化碳引起的肝損傷[11]。杜金梁等[12]研究發(fā)現(xiàn)虎杖提取物能有效提高鯉(Cyprinuscarpio)肝細(xì)胞抗氧化能力，抑制肝細(xì)胞損傷。但關(guān)于虎杖提取物對(duì)魚(yú)類(lèi)脂肪肝病干預(yù)方面的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本研究以尼羅羅非魚(yú)(Oreochromisniloticus)為研究對(duì)象，用高脂飼料誘導(dǎo)建立脂肪性肝損傷模型，同時(shí)在飼料中添加虎杖提取物，探究其對(duì)尼羅羅非魚(yú)脂肪肝的干預(yù)作用，為魚(yú)類(lèi)保肝飼料添加劑的開(kāi)發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚(yú)

實(shí)驗(yàn)用魚(yú)取自中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心漁場(chǎng)，體質(zhì)健康，無(wú)傷，規(guī)格基本一致。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將尼羅羅非魚(yú)暫養(yǎng)于循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中(水溫：(30±3) ℃；pH 6.8～7.6；溶解氧>6 mg/L；總氨氮<0.1 mg/L；亞硝酸鹽<0.1 mg/L，每天換水10%)進(jìn)行馴化，以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境，并以3%體重的基礎(chǔ)飼料飼喂，每日兩次，連續(xù)14 d。

1.2 試劑

虎杖提取物(10 ∶1)購(gòu)自于西安匯林生物科技有限公司；實(shí)驗(yàn)所用的麻醉劑和磷酸鹽緩沖液購(gòu)自于Sigma Company (St.Louis，MO，USA)。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將尼羅羅非魚(yú)隨機(jī)分為4組，正常組：飼喂基礎(chǔ)飼料(6%粗脂肪)；高脂組：飼喂高脂飼料(21%粗脂肪)；2.5 g/kg虎杖提取物處理組：飼喂含2.5 g/kg虎杖提取物的高脂飼料；5 g/kg虎杖提取物處理組：飼喂含5 g/kg虎杖提取物的高脂飼料。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30尾魚(yú)。飼養(yǎng)60 d后，對(duì)所有魚(yú)稱(chēng)重。然后每組隨機(jī)選取12尾魚(yú)，采集血液和肝組織。血液樣品通過(guò)離心(5 000 r/min，10 min)分離血清，儲(chǔ)存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 生化指標(biāo)測(cè)定

甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-c)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-c)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、超氧化物歧化酶(SOD)、總抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA) 等生化指標(biāo)均按照相應(yīng)的試劑盒(南京建成生物工程研究所)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。

1.5 基因表達(dá)檢測(cè)

分別采集正常組、高脂組、2.5 g/kg虎杖提取物處理組以及5 g/kg虎杖物處理組的肝組織，檢測(cè)IL-1β和PPAR-α基因相對(duì)表達(dá)量。使用RNAiso Plus試劑(TaKaRa，大連)提取肝組織中總RNA，通過(guò)分光光度計(jì)檢測(cè)其含量和純度(A260/A280:1.8～2.1)，然后取適量的RNA(1 μg)，使用PrimeScriptTMRT試劑進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，操作方法根據(jù)試劑盒說(shuō)明。

根據(jù)TB GreenTMPremix Ex TaqTMII kit說(shuō)明檢測(cè)IL-1β和PPARα基因相對(duì)表達(dá)量：PCR反應(yīng)條件：95 ℃、30 s預(yù)變性，然后 95 ℃、5 s變性，60 ℃、1 min退火延伸，40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，使用2-△△Cq計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量。特異性引物見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR引物Tab.1 The primer sequences of qRT-PCR

1.6 計(jì)算公式

特定生長(zhǎng)率(SGR，%/d)=100%×(lnWt-lnW0)/t

餌料系數(shù)(FCR)=FI/(Wt-W0)

式中，W0為魚(yú)初體均重(g)；Wt為魚(yú)末體均重(g)；t為飼喂天數(shù)(d)；FI為每尾魚(yú)平均攝食飼料總量(風(fēng)干樣重)(g)。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，其值以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。各組間數(shù)據(jù)差異通過(guò)單因素方差進(jìn)行(ANOVA)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并對(duì)不同組間數(shù)據(jù)進(jìn)行Tukey多重比較，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 虎杖提取物對(duì)尼羅羅非魚(yú)生長(zhǎng)的影響

表2數(shù)據(jù)顯示，投喂60 d后，高脂組特定生長(zhǎng)率(SGR)略低于正常組，而餌料系數(shù)略高于正常組，但均無(wú)顯著性差異，表明高脂飼料投喂60 d后對(duì)尼羅羅非魚(yú)生長(zhǎng)無(wú)明顯影響。正常組、高脂組以及兩個(gè)虎杖提取物處理組的SGR和餌料系數(shù)均無(wú)顯著差異，表明不同劑量的虎杖提取物添加對(duì)尼羅羅非魚(yú)生長(zhǎng)并無(wú)顯著影響。

表2 虎杖提取物對(duì)尼羅羅非魚(yú)生長(zhǎng)的影響Tab.2 Effects of PCE on the growth of O.niloticus

2.2 虎杖提取物對(duì)尼羅羅非魚(yú)血脂水平的影響

高脂飼料投喂后，尼羅羅非魚(yú)TG、TC、LDL-c、HDL-c含量顯著升高。與高脂組相比，5 g/kg虎杖提取物組TG、TC、LDL-c、HDL-c含量均顯著降低；2.5 g/kg虎杖提取物組僅TG含量顯著降低。而兩個(gè)虎杖提取物處理組間無(wú)顯著差異。同時(shí)，虎杖提取物對(duì)尼羅羅非魚(yú)血脂水平的影響呈劑量依賴(lài)性，即5g/kg虎杖提取物組效果較好(圖1)。

圖1 虎杖提取物對(duì)尼羅羅非魚(yú)血脂水平的影響Fig.1 The effects of PCE on the blood lipid level in O.niloticus不同字母表示組間具有差異顯著P<0.05，下同

2.3 虎杖提取物對(duì)尼羅羅非魚(yú)血清GPT和GOT活力的影響

與正常組相比，高脂飼料投喂60 d后，尼羅羅非魚(yú)血清中GPT和GOT活性均顯著提高，表明尼羅羅非魚(yú)肝組織受損。 而經(jīng)2.5 g/kg、5 g/kg虎杖提取物處理后， GPT活性均顯著下降；GOT活性也呈下降趨勢(shì)，但差異不顯著(圖2)。結(jié)果表明虎杖提取物可部分改善尼羅羅非魚(yú)肝損傷。

圖2 虎杖提取物對(duì)尼羅羅非魚(yú)GPT和GOT活性的影響Fig.2 The effects of PCE on GPT and GOT activities in O.niloticus

2.4 虎杖提取物對(duì)尼羅羅非魚(yú)肝臟中TG和TC含量的影響

由圖 3 可知，與正常組相比，高脂組中肝臟TG和TC含量均顯著升高。2種劑量虎杖提取物組中肝臟TG和TC含量均呈下降趨勢(shì)，但5 g/kg虎杖提取物組TG和TC含量顯著降低，表明高劑量虎杖提取物處理可有效改善尼羅羅非魚(yú)肝脂肪的沉積。

圖3 虎杖提取物對(duì)尼羅羅非魚(yú)肝TG和TC含量的影響Fig.3 The effects of PCE on hepatic TG and TC levels in O.niloticus

2.5 虎杖提取物對(duì)尼羅羅非魚(yú)肝組織抗氧化能力的影響

由圖4所示，高脂組SOD、T-AOC和GSH水平明顯低于正常組，而MDA含量明顯高于正常組，表明高脂飼料投喂引起氧化損傷和脂質(zhì)過(guò)氧化。與高脂組相比，虎杖提取物組SOD活性顯著提高、T-AOC和GSH含量顯著增加， MDA含量顯著降低； 2.5 g/kg虎杖提取物組SOD活性顯著提高和GSH含量顯著增加， MDA含量顯著降低。表明虎杖提取物可有效阻止高脂飼料誘導(dǎo)的氧化損傷和脂質(zhì)過(guò)氧化。

圖4 虎杖提取物對(duì)尼羅羅非魚(yú)肝組織抗氧化能力的影響Fig.4 The effects of PCE on anti-oxidative capacity in liver of O.niloticus

2.6 虎杖提取物對(duì)尼羅羅非魚(yú)IL-1β和PPAR-α基因表達(dá)的影響

由圖5可知，與正常組相比，高脂飼料投喂顯著上調(diào)了促炎性因子白細(xì)胞介素1β (IL-1β)基因表達(dá)，而顯著下調(diào)了過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α(PPAR-α)基因表達(dá)。與高脂組相比，2.5和5 g/kg虎杖提取物組顯著抑制了IL-1β基因表達(dá)；而5 g/kg虎杖提取物組PPAR-α基因表達(dá)顯著提高，表明虎杖提取物具有緩解炎癥反應(yīng)和促進(jìn)肝脂肪代謝的作用。

圖5 虎杖提取物對(duì)尼羅羅非魚(yú)IL-1β和PPAR-α基因表達(dá)的影響Fig.5 The effects of PCE on IL-1β and PPAR-α gene expression in liver of O.niloticus

3 討論

魚(yú)類(lèi)脂肪肝經(jīng)常伴隨著血脂水平的升高，如TG、TC、LDL-c和HDL-c。因此血脂水平常被用于脂肪肝評(píng)估。本研究結(jié)果顯示，高脂飼料投喂60 d后，尼羅羅非魚(yú)血脂水平顯著升高，表明尼羅羅非魚(yú)出現(xiàn)明顯的脂肪肝。而虎杖提取物處理后血脂水平明顯降低，表明虎杖提取物可調(diào)節(jié)脂肪代謝、降低血脂水平、緩解脂肪肝的發(fā)生。類(lèi)似的結(jié)果在哺乳動(dòng)物中也發(fā)現(xiàn)[13,14]。肝組織中過(guò)多的脂質(zhì)沉積通常引起肝損傷，導(dǎo)致肝細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)可溶性酶，如GPT和GOT大量釋放進(jìn)入血液。因此GPT和GOT是判斷肝損傷重要標(biāo)志。本研究中，高脂飼料投喂60 d后，血清中GPT和GOT的活性顯著增加，表明高脂飼料投喂引起嚴(yán)重的肝損傷。而虎杖提取物明顯緩解了GPT活性上升，而對(duì)GOT活性無(wú)明顯影響。表明虎杖提取物可部分地緩解高脂飼料誘導(dǎo)的肝損傷。同樣，在鯉的研究中也顯示虎杖提取物可降低血清中GPT和GOT活性，抑制急性肝損傷[12,15]。

大量的研究發(fā)現(xiàn)，在脂肪肝發(fā)生和發(fā)展中，氧化應(yīng)激發(fā)揮重要的作用。SOD、GSH和T-AOC是評(píng)價(jià)機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)的重要指標(biāo)[16-18]。而MDA 是氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過(guò)氧化物的代謝產(chǎn)物，其含量變化反映了脂質(zhì)過(guò)氧化程度。杜金梁等[15]研究發(fā)現(xiàn)，虎杖提取物能顯著提高T-AOC、SOD、GSH含量，降低MDA含量，防治鯉肝損傷。本研究數(shù)據(jù)顯示，高脂飼料引起肝組織抗氧化指標(biāo)SOD、GSH和T-AOC水平降低，而5 g/kg虎杖提取物處理組中SOD、GSH和T-AOC水平顯著升高，表明高劑量虎杖提取物能促進(jìn)尼羅羅非魚(yú)肝組織中抗氧化酶活力和抗氧化物質(zhì)的形成，進(jìn)而清除多余的自由基，抑制高脂飼料引起的氧化應(yīng)激，阻礙進(jìn)一步的肝損傷發(fā)生。同時(shí)，虎杖提取物顯著降低MDA含量，表明虎杖提取物能夠抑制肝組織中脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)生，阻止肝細(xì)胞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)與功能受損。這與在小鼠中的研究結(jié)果一致[14]。

研究表明長(zhǎng)期的高脂飼料投喂可促使肝臟分泌炎癥因子，其中IL-1β為主要的促炎癥因子，在肝損傷發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[19]。IL-1β可誘導(dǎo)其他炎癥因子、趨化因子和黏附分子分泌，參與炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)代謝和免疫調(diào)節(jié)[20]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期的高脂飼料投喂導(dǎo)致尼羅羅非魚(yú)肝臟炎癥基因IL-1β表達(dá)明顯上調(diào)，而IL-1β基因表達(dá)的上調(diào)在兩種劑量虎杖提取物處理組中均受到明顯抑制，表明虎杖提取物可抑制肝臟炎癥反應(yīng)，阻礙肝組織進(jìn)一步損傷。

肝細(xì)胞中，脂肪沉積主要與脂肪酸合成和β-氧化相關(guān)。PPAR-α為脂肪酸β-氧化的關(guān)鍵調(diào)控因子[21]。PPAR-α的上調(diào)可促進(jìn)脂肪酸分解，降低脂質(zhì)沉積。很多研究顯示，高脂飼料誘導(dǎo)的脂肪肝中，PPAR-α基因或蛋白表達(dá)被抑制[22,23]。本研究結(jié)果也顯示，高脂飼料投喂60 d后，尼羅羅非魚(yú)PPAR-α基因表達(dá)明顯下調(diào)，表明尼羅羅非魚(yú)脂肪肝發(fā)生與脂肪酸β-氧化抑制有關(guān)。而虎杖提取物處理后，PPAR-α基因表達(dá)明顯上調(diào)，表明虎杖提取物可促進(jìn)肝細(xì)胞脂肪酸β-氧化，抑制脂肪過(guò)度的沉積，緩解脂肪肝發(fā)生。

綜上所述，虎杖提取物可干預(yù)高脂飼料引起的尼羅羅非魚(yú)肝脂肪代謝紊亂；同時(shí)可提高抗氧化狀態(tài)、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化和炎癥反應(yīng)，緩解高脂飼料誘導(dǎo)的脂肪性肝損傷。