李樹斌 于 鴻 張耿月

肺癌是世界范圍內(nèi)癌癥死亡的主要原因[1-3]。近年來，雖然臨床和實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)研究都取得了可喜的進(jìn)展，但肺癌患者的預(yù)后仍不理想，5年總生存率僅在15%左右。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)約占所有肺癌病例的85%[2-3]。2004年在NSCLC患者中首次發(fā)現(xiàn)表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)突變。研究表明，大多數(shù)攜帶EGFR突變的患者對EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs)如厄洛替尼(erlotinib)和吉非替尼(gefitinib)治療敏感。然而這些對治療敏感的患者在治療10～16個月后會不可避免的獲得抗藥性，導(dǎo)致癌癥進(jìn)展[4]。本文分析了1個NSCLC 厄洛替尼耐藥芯片數(shù)據(jù)集，篩選與厄洛替尼耐藥相關(guān)的差異表達(dá)mRNAs和lncRNAs，并通過生物信息學(xué)方法對獲得的結(jié)果進(jìn)行初步驗(yàn)證。

材料和方法

一、數(shù)據(jù)下載和mRNAs差異表達(dá)分析

在Gene Expression Omnibus(GEO)數(shù)據(jù)庫中挑選合適的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集GSE80344[5]。該數(shù)據(jù)集的數(shù)據(jù)來自厄洛替尼耐藥的HCC827細(xì)胞和敏感細(xì)胞[6]，技術(shù)平臺為GPL16699：Agilent-039494 SurePrint G3 Human GE v2 8×60K Microarray 039381(http://www.agilent.com)。首先下載全部注釋文件和原始數(shù)據(jù)，去掉不相關(guān)的樣本信息和數(shù)據(jù)，然后通過GEO2R分析差異表達(dá)基因，篩選標(biāo)準(zhǔn)為|Fold change|>1.5，Pvalue<0.01。對于多個探針對應(yīng)一個基因的情況，取平均值作為這個基因的表達(dá)值。

二、厄洛替尼耐藥的HCC827細(xì)胞的差異表達(dá)mRNAs的gene ontology(GO)和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)pathway分析

GO分析通過Panther(http://www.pantherdb.org)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行，篩選出的差異表達(dá)基因按照3個類別進(jìn)行功能分類：molecular function(MF)、biological process(BP)、cellular component(CC)。然后通過KEGG(http://www.kegg.jp/)數(shù)據(jù)庫分析篩選得到的差異表達(dá)mRNAs通過哪些信號通路發(fā)揮作用。

三、構(gòu)建蛋白相互作用(protein-protein interaction, PPI)網(wǎng)絡(luò)

通過STRING(http://string-db.org)數(shù)據(jù)庫將篩選得到的厄洛替尼耐藥的HCC827細(xì)胞的差異表達(dá)mRNAs轉(zhuǎn)化為基因編碼蛋白構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，將得到的結(jié)果用MCODE of Cytoscape軟件分析，得到蛋白相互作用關(guān)系圖并從中挑選出關(guān)鍵的候選基因[7]。

四、厄洛替尼耐藥的HCC827細(xì)胞的差異表達(dá)lncRNAs表達(dá)譜分析

通過https://www.gencodegenes.org/releases/current.html 下載lncRNAs注釋信息并與Agilent probe set ID匹配得到Agilent芯片的lncRNAs注釋信息，再將1.1中下載的原始表達(dá)數(shù)據(jù)與lncRNAs注釋信息匹配[8]，得到厄洛替尼耐藥的HCC827細(xì)胞的差異表達(dá)lncRNAs。

五、厄洛替尼耐藥的HCC827細(xì)胞的差異表達(dá)lncRNA-mRNA相互作用的CNC(coding-non-coding)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

六、厄洛替尼耐藥的HCC827細(xì)胞的差異表達(dá)lncRNAs的GO分析和KEGG分析 與1.2的分析方法相同。

七、驗(yàn)證篩選得到的關(guān)鍵基因與肺癌患者臨床特征的相關(guān)性

使用蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證篩選得到的關(guān)鍵基因與肺癌患者預(yù)后(overall survival, OS)的相關(guān)性(https://cancergenome.nih.gov/)，驗(yàn)證數(shù)據(jù)來自TCGA(the Cancer Genome Atlas)。

結(jié) 果

一、篩選厄洛替尼耐藥的HCC827細(xì)胞的差異表達(dá)mRNAs結(jié)果

在數(shù)據(jù)集GSE80344中選擇厄洛替尼耐藥的HCC827細(xì)胞和敏感細(xì)胞作為分析對象，將樣本分為敏感細(xì)胞組(GSM2124850、GSM2124858)和耐藥細(xì)胞組(GSM2124846、GSM2124847、GSM2124849、GSM2124852、GSM2124853、GSM2124854、GSM2124855、GSM2124857、GSM2124860、GSM2124861)。通過GEO自帶的GEO2R分析工具，我們最終得到差異表達(dá)mRNAs共644個(耐藥細(xì)胞vs.敏感細(xì)胞)，其中128 mRNAs表達(dá)上調(diào)，516 mRNAs表達(dá)下調(diào)，見表1。

表1 厄洛替尼耐藥的HCC827細(xì)胞的差異表達(dá)mRNAs(差異表達(dá)顯著的前100 mRNAs，耐藥細(xì)胞 vs.敏感細(xì)胞)

二、厄洛替尼耐藥的HCC827細(xì)胞的差異表達(dá)mRNAs的GO分析和KEGG結(jié)果

上述篩選得到的差異表達(dá)mRNAs的功能富集分析，見圖1。主要基于molecular function(MF)、biological process(BP)、cellular component(CC)三個類別。這些mRNAs通過參與與癌癥有關(guān)的信號通路發(fā)揮作用，這些信號通路主要包括癌癥的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、Ras信號通路、PI3K-Akt信號通路、p53信號通路等。

圖1 厄洛替尼耐藥的HCC827細(xì)胞的差異表達(dá)mRNAs的GO分析結(jié)果圖

三、構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)

為了進(jìn)一步挖掘厄洛替尼耐藥相關(guān)的關(guān)鍵基因，我們通過STRING(http://string-db.org)數(shù)據(jù)庫和MCODE of Cytoscape軟件構(gòu)建了蛋白相互作用網(wǎng)路，計(jì)算結(jié)果來自414 nodes和427 edges。

四、厄洛替尼耐藥的HCC827細(xì)胞的差異表達(dá)lncRNAs結(jié)果

通過對探針的注釋匹配，我們共匹配到10353 Agilent probe set ID，對應(yīng)6539 lncRNAs(包括TEC、sense_overlapping、sense_intronic、processed_transcript、lincRNA、bidirectional_promoter_lncRNA、antisense、3prime_overlapping_ncRNA)。再將獲得的結(jié)果與篩選的差異表達(dá)mRNAs的結(jié)果匹配，按照表達(dá)值│Fold change│> 1.0的標(biāo)準(zhǔn)，最終得到了差異表達(dá)的367 lncRNAs，其中137 lncRNAs表達(dá)上調(diào)，230 lncRNAs表達(dá)下調(diào)(耐藥細(xì)胞vs.敏感細(xì)胞)。我們注意到篩選出的lncRNAs數(shù)量大約是mRNAs的一半，這與文獻(xiàn)的報道一致，提示我們lncRNAs的表達(dá)在敏感和耐藥細(xì)胞之間可能更保守[9]。

五、厄洛替尼耐藥的HCC827細(xì)胞的差異表達(dá)lncRNA-mRNA的CNC共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

基于相關(guān)性分析的CNC網(wǎng)路可以用于分析lncRNAs的功能和作用機(jī)制，我們的結(jié)果表明有23 個關(guān)鍵的lncRNAs，包括表達(dá)上調(diào)的lncRNA RP11-620J15.3、RP11-227F19.2(LNC-LIMCH1-1)、LINC00472、CTD-3110H11.3、RP11-386G11.8(LNC-TUBA1C-2)、RP11-523L20.1(LINC02134)、AC005592.2(SPRY4-AS1)、CTD-3094K11.1(LNC-BLM-6)、ST7OT1(ST7-AS1)、RP1-232P20.1、RP4-781K5.5(LNC-COA6-6)、RP11-165M6.1(LINC00460)、RP11-442N24_B.1(LINC01715)；表達(dá)下調(diào)的lncRNA RP11-115J16.1、RP4-798P15.3、AP001422.3(LINC01423)、AC107070.1(LINC01304)、RP11-783K16.14(LNC-TRPT1-1)、AC145676.2、RP11-498P14.4(LNC-CCDC180-4)、RP6-65G23.3(LNC-PCNX1-2)、AC097499.1(LINC01889)、AC084809.3(LNC-TMEM98-2)在CNC網(wǎng)絡(luò)中與mRNAs相互作用。這些lncRNAs中的大多數(shù)尚未見報道。一個lncRNA可以與多個mRNAs共表達(dá)，多個lncRNAs也可以與一個mRNA共表達(dá)，說明lncRNAs和mRNAs之間的相互作用的復(fù)雜性。

六、厄洛替尼耐藥的HCC827細(xì)胞的差異表達(dá)lncRNAs的GO和KEGG分析結(jié)果

篩選得到的lncRNAs的功能可能主要涉及免疫功能、代謝途徑以及癌癥相關(guān)信號通路。

七、篩選得到的mRNAs和lncRNAs與NSCLC患者臨床特征的相關(guān)性結(jié)果

為了驗(yàn)證上述分析結(jié)果的可靠性，我們使用來自TCGA的肺腺癌患者(Lung Adenocarcinoma, LUAD)的臨床數(shù)據(jù)分析篩選得到的mRNAs和lncRNAs與患者臨床預(yù)后的相關(guān)性(https://cancergenome.nih.gov/, http://www.oncolnc.org/)。這些基因包括差異表達(dá)篩選中平均表達(dá)值倍數(shù)變化較大的和PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因，見圖2。從圖2可見，肺腺癌患者GPR68和VNN1高表達(dá)，MUC1和PRODH低表達(dá)，這些患者的總生存期降低，預(yù)后差。篩選得到的差異表達(dá)的lncRNAs中LINC00087(SMIM10L2B)和H19低表達(dá)的肺腺癌患者的總生存期顯著降低。這些結(jié)果初步證明我們上述分析結(jié)果的可靠性。

討 論

本文的原始數(shù)據(jù)來自GEO數(shù)據(jù)庫。我們在GEO數(shù)據(jù)庫中挑選合適的表達(dá)譜數(shù)據(jù)集GSE80344[5]。該數(shù)據(jù)集的數(shù)據(jù)來自厄洛替尼耐藥的HCC827細(xì)胞和敏感細(xì)胞[6]，技術(shù)平臺為Agilent-039494 SurePrint G3 Human GE v2 8x60K Microarray 039381。Agilent公司的SurePrint技術(shù)可以靈活地、大規(guī)模地原位合成60mer的寡核苷酸探針，每個探針的設(shè)計(jì)都經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)篩選優(yōu)化，其CV值、檢測基因數(shù)目、與Taqman探針的重復(fù)性均處于國際同行業(yè)領(lǐng)先水平。

圖2 來自TCGA數(shù)據(jù)庫的肺腺癌患者的總生存期分析

通過篩選分析，我們最終得到差異表達(dá)mRNAs共644個(耐藥細(xì)胞vs.敏感細(xì)胞)。GO分析結(jié)果表明，這些mRNAs的功能主要涉及應(yīng)激、代謝、免疫、黏附等生物學(xué)進(jìn)程(biological process, BP)，突觸、細(xì)胞連接、細(xì)胞外基質(zhì)等細(xì)胞成分(cellular component, CC)，受體活性、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、催化活性等重要的分子功能(molecular function, MF)。通過與癌癥有關(guān)的信號通路發(fā)揮作用，這些信號通路主要包括癌癥的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、Ras信號通路、PI3K-Akt信號通路、p53信號通路等。其中涉及到的關(guān)鍵的mRNAs包括FGFR1、SATB2、PTX3、AXL、SOX7、H19、MUC1、ICAM2、TP53、IGF1等，這些基因中即有被廣泛研究報道的，也有未見報道的，這為我們深入研究EGFR-TKIs的耐藥機(jī)制提供了有價值的線索。

通過構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，我們對篩選得到的與厄洛替尼耐藥相關(guān)的差異表達(dá)mRNAs進(jìn)行更深入的分析，得到處于相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的基因，這些基因包括CXCR4、PMCH、HTR1A、OPRM1、GNG7、CXCL2、GNGT2、CXCL6、ADORA1、APLN、CXCL13、CD40、IL7、CD5、IL4R、CD19、IRF8、IL1A、KLRC1、MUC1、CSF2、TP53、IFNG等，這些基因主要在細(xì)胞因子及其受體的相互作用、PI3K-Akt信號通路、Jak-STAT信號通路、癌癥的轉(zhuǎn)錄因子失調(diào)、NF-κappa B信號通路等中發(fā)揮作用，進(jìn)一步證明我們篩選得到的基因可能在NSCLC EGFR-TKIs耐藥中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

與同類研究相比，我們篩選得到的結(jié)果中如CEACAM6、CALB1、ICAM2、CEACAM6、CKMT1A、ATP8A1、ADORA1等差異表達(dá)基因已有同類報道[9-10]，其余大部分基因未見相關(guān)報道，這主要是由樣本選擇和分析方法的差異造成的。

近年來數(shù)以萬計(jì)的lncRNAs被發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)模式的改變與不同類型癌癥的發(fā)生和惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)，但lncRNAs表達(dá)譜的潛在用途仍然沒有被系統(tǒng)研究。在多種腫瘤類型中，異常表達(dá)的lncRNAs已經(jīng)被研究作為潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[11-12]。lncRNAs的長度大于200 nt(nucleotides)，缺乏或沒有蛋白編碼能力，可參與多種生物學(xué)過程，包括X染色質(zhì)印跡、細(xì)胞分化、選擇性剪接、細(xì)胞命運(yùn)決定、免疫反應(yīng)等[14]。lncRNAs也可以通過不同的機(jī)制，如表觀遺傳修飾、作為miRNA的競爭RNA等調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移[15]。

目前一些研究已經(jīng)證明lncRNAs，如HOTAIR[16]、MEG3[17]、CCAT1[18]等在NSCLC化療耐藥中發(fā)揮作用。但是非小細(xì)胞肺癌EGFR-TKIs耐藥中l(wèi)ncRNAs的表達(dá)模式和潛在的功能仍然是未知的。Ma等[19]從GEO數(shù)據(jù)庫中下載了3個數(shù)據(jù)集，分別是吉非替尼耐藥的GSE34228，厄洛替尼耐藥的GSE38310，crizotinib或X-376耐藥的GSE49508。他們隨后分析了這3個數(shù)據(jù)集的lncRNAs表達(dá)譜，從表達(dá)失調(diào)的lncRNAs中選取了上調(diào)的CASC9和下調(diào)的EWAST1(LINC00227)作為研究對象，用Pearson相關(guān)系數(shù)計(jì)算與之共表達(dá)的蛋白編碼基因，推測CASC9和LINC00277可能通過與這些PCGs相互作用調(diào)節(jié)EGFR-TKIs耐藥。Cheng[14]等分析了EGFR-TKIs敏感的PC9和耐藥的PC9/R肺癌細(xì)胞的lncRNAs表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)耐藥細(xì)胞和敏感細(xì)胞相比共有22,587 lncRNAs和17,479 mRNAs差異表達(dá)。他們發(fā)現(xiàn)上調(diào)的lncRNAs-BC087858位于一個與癌癥發(fā)展相關(guān)的FOX轉(zhuǎn)錄因子家族成員FOXC1(forkhead box protein C1)附近。FOXC1可以通過抑制E-cadherin表達(dá)誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲。FOXC1的表達(dá)也可以被EGF/ERK(epidermal growth factor/extracellular signal-related kinase)信號通路激發(fā)[20]。因此推測BC087858可能通過EMT在EGFR-TKIs耐藥中發(fā)揮作用。Xue等[9]利用GEO的數(shù)據(jù)集GSE49644和GSE60189構(gòu)建了肺癌耐藥的lncRNAs-mRNAs共表達(dá)功能性網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果表明有32 lncRNAs和81 mRNAs相互調(diào)節(jié)，其中起關(guān)鍵作用的是COL1A1、COL27A1、BMPR2。作者接著分析了lncRNAs和mRNAs與肺癌患者預(yù)后的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)2對lncRNAs-mRNAs與耐藥高度相關(guān)。Wu等[10]分析了對吉非替尼耐藥的HCC827-8-1和敏感細(xì)胞HCC827的lncRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)有1,476 lncRNAs和1,026 mRNAs表達(dá)失調(diào)。作者在構(gòu)建的lncRNA-TF(transcription factors)網(wǎng)絡(luò)中，篩選出了4個關(guān)鍵基因：E2F4、E2F1、uSF1、TFAP2C。它們可能在EGFR-TKIs耐藥中發(fā)揮重要作用。

本文分析了厄洛替尼耐藥的HCC827細(xì)胞的差異表達(dá)lncRNAs表達(dá)譜并篩選出差異表達(dá)顯著的lncRNAs。參考文獻(xiàn)報道的方法[8]，我們得到了與厄洛替尼耐藥相關(guān)的差異表達(dá)lncRNAs共367個。這些lncRNAs可能在耐藥發(fā)生中發(fā)揮潛在作用，其中一些lncRNAs被報道在癌癥或其它疾病中異常表達(dá)，如ST7OT1(ST7-AS1)和LINC00472，lncRNA-H19已被報道與吉非替尼耐藥相關(guān)[14]。我們的分析發(fā)現(xiàn)了很多新lncRNAs，到目前為止還沒有在肺癌或其它腫瘤中被研究過，它們的功能尚待確定。

分析mRNAs-lncRNAs的共表達(dá)可以預(yù)測lncRNAs的功能[9]，通過構(gòu)建差異表達(dá)lncRNA-mRNA的CNC共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，我們得到了23 個關(guān)鍵的差異表達(dá)lncRNAs，其中表達(dá)上調(diào)的lncRNAs共13個，表達(dá)下調(diào)的lncRNAs共10個。這些lncRNAs中的大多數(shù)尚未見報道。GO分析和KEGG分析結(jié)果表明，這些lncRNAs的功能可能涉及細(xì)胞因子及其受體的相互作用、P53信號通路、藥物代謝、Ecm受體的相互作用等與癌癥有關(guān)的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)一步說明EGFR-TKIs耐藥以及l(fā)ncRNAs和mRNAs之間的相互作用的復(fù)雜性。

篩選得到的lncRNAs既可以作為耐藥的標(biāo)志，也可以作為診斷和治療的新靶點(diǎn)。迄今為止相關(guān)的研究尤其關(guān)于EGFR-TKIs耐藥相關(guān)的研究報道還比較少。Cheng等[21]研究了NSCLC中l(wèi)ncRNA UCA1在EGFR-TKIs獲得性耐藥中的作用。結(jié)果表明，UCA1可能通過活化AKT/mTOR和ERK通路和EMT 促進(jìn)吉非替尼耐藥。已報道lncRNA BC087858在吉非替尼耐藥的NSCLC細(xì)胞中高表達(dá)[14]。Pan等[22]檢測了不同NSCLC細(xì)胞和EGFR-TKIs耐藥的腫瘤組織中l(wèi)ncRNA BC087858的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)lncRNA BC087858的NSCLC患者預(yù)后差。BC087858能夠通過上調(diào)Snail和ZEB1表達(dá)促進(jìn)EMT，也能通過上調(diào)pEGFR、pAKT、pERK表達(dá)活化PI3K/AKT和MEK/ERK信號通路，從而促進(jìn)EGFR-TKIs耐藥。Wang等[23]分析了對吉非替尼耐藥的PC9-R細(xì)胞和敏感細(xì)胞的lncRNA表達(dá)譜之間的差異。結(jié)果表明MIR31HG通過促進(jìn)p-EGFR、p-PI3K、p-AKT、p-Mdm-2表達(dá)活化EGFR/PI3K/AKT信號通路在吉非替尼耐藥中發(fā)揮作用。一個已知的LncRNA，生長停滯特異性轉(zhuǎn)錄因子5(growth arrest-specific transcript 5, GAS5)被報道在肺癌組織中表達(dá)降低[24]，并與較大的腫瘤體積、低分化、較高的TNM分期相關(guān)[25]。

為了驗(yàn)證篩選得到的差異表達(dá)lncRNAs和mRNAs與肺癌患者臨床特征之間的相關(guān)性，我們通過來自TCGA的肺腺癌患者的臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行生存分析驗(yàn)證，初步證明我們的數(shù)據(jù)分析的可靠性。

本文也存在不足之處。首先，對于許多已被鑒定出來的lncRNAs來說，有關(guān)它們的可能的作用途徑的信息仍然是有限的，雖然它們的差異表達(dá)模式提示在NSCLC EGFR-TKIs耐藥中有潛在作用，但缺乏直接的證據(jù)支持。第二，Agilent 芯片代表大部分但不是所有可能存在的lncRNAs。我們鑒定出的候選lncRNAs也不能代表全部可能在NSCLC EGFR-TKIs耐藥中發(fā)揮作用的lncRNAs。第三，我們使用的數(shù)據(jù)集是分類不均衡的，樣本量太少，這樣的數(shù)據(jù)不平衡會增加小樣本數(shù)據(jù)的一些重要屬性被忽略的可能性。第四，臨床樣本和細(xì)胞樣本的基因表達(dá)譜是有差異的。

對于后續(xù)的研究設(shè)想，綜合我們的分析結(jié)果和相關(guān)文獻(xiàn)報道，腫瘤耐藥與腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)密切相關(guān)。在NSCLC中，EMT也被報道與TKI類藥物的耐藥有關(guān)。在我們篩選得到的與厄洛替尼耐藥有關(guān)的差異表達(dá)lncRNAs和mRNAs中，GAS6/AXL通過調(diào)節(jié)EMT促進(jìn)NSCLC EGFR-TKIs耐藥[26-27]。AXL是酪氨酸激酶受體，GAS6是AXL的配體。在多種類型的腫瘤中，AXL過表達(dá)與細(xì)胞生存、增殖、侵襲、遷移，細(xì)胞間黏附、抗凋亡等生物學(xué)過程相關(guān)[28]，同時AXL可以誘導(dǎo)PI3K/AKT、STAT3、MAPK、nuclear factor κB下游活化。我們的結(jié)果表明與GAS6和AXL相互作用的lncRNAs有SPRY4-AS1(SPRY4 antisense RNA 1)、LINC00460、LINC01715、LINC00472、RP6-65G23.3、RP11-620J15.3、CTD-3110H11.3、RP11-165M6.1等。這些lncRNAs的功能尚未被深入研究，對于它們與GAS6/AXL之間的相互作用的研究可能有助于發(fā)現(xiàn)新的診斷和治療EGFR-TKIs耐藥的靶點(diǎn)。