舒亦雄，徐秀芬，李登，楊文君，段杉

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院 廣東省功能食品活性物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣東省天然活性物工程技術(shù)研究中心，廣州 510642)

我國是世界上對蝦產(chǎn)量最大、消費(fèi)量最多的國家，我國的蝦養(yǎng)殖以南美對蝦為主，主要是對外出口蝦仁[1]。加工蝦仁后，產(chǎn)生大量蝦殼、蝦頭和其他廢棄物，占整蝦的30%～40%。這些蝦頭、蝦殼廢棄物除了富含蛋白質(zhì)、蝦青素、脂肪酸和多種氨基酸等營養(yǎng)成分外[2]，還含有鈣、鉀、鈉、鎂等常量元素和鐵、鋅、銅、錳、硒、鈷、鎳7種人體必需的微量元素[3]。目前我國蝦副產(chǎn)品沒有得到有效的利用，如何科學(xué)開發(fā)蝦廢棄物資源，提高其經(jīng)濟(jì)價值，已成為目前亟待解決的問題。醬油是我國傳統(tǒng)的調(diào)味品，深受人們的喜愛，近年來醬油產(chǎn)銷量逐年增加[4]。但是隨著黃豆等原材料價格的上漲，醬油的成本增加，尋找新的原料代替[5,6]、提高原料的利用率、增強(qiáng)產(chǎn)品的風(fēng)味、提升醬油產(chǎn)品的附加值成為研究的迫切需求。目前最常用的醬油原料是黃豆，其中的蛋白質(zhì)含量為38.45%[7]，而蝦殼中蛋白質(zhì)含量約為20%～40%[8]，且氨基酸種類齊全，尤其富含鮮味氨基酸[9]，在發(fā)酵調(diào)味品方面應(yīng)用潛力巨大[10]，可以作為海鮮醬油的原料。本文模仿大豆醬油的制曲工藝，以蝦殼和面粉為原料，接種米曲霉制曲，摸索制曲工藝條件，為進(jìn)一步釀造醬油奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

南美白對蝦(Penaeusvannamei)的蝦殼：購于湛江；米曲霉滬釀3.042：購于沂水錦潤生物科技有限公司；面粉：購于濱州中裕食品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DK-8D型電熱恒溫水槽 上海森信試驗(yàn)儀器有限公司；SW-CJ-1FDA 型超凈工作臺 蘇州安凈凈化技術(shù)有限公司；101-1型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海滬南科學(xué)儀器有限公司；Climace 11404人工氣候箱 廣州市科啟生物科技有限公司；紫外分光光度計(jì) 上海安亭科學(xué)儀器總廠；JA2003電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；LDZX-40B型立式自控電熱蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 制曲工藝流程

1.3.2 工藝說明

取南美白對蝦的蝦殼烘干后粉碎，混勻。取適量蝦殼按照一定比例(W/W)加入面粉，然后加入一定量70 ℃蒸餾水混勻，靜置1 h后于高壓鍋100 ℃滅菌。取出曲料并于室溫冷卻至30 ℃，接種米曲霉(Aspergillusoryzae)曲精。將上述接種后的曲料置于塑料筐中，塑料筐事先用滅菌的濕紗布(4層，紗布潤濕不滴水)覆蓋底部和表面。將曲料置于溫度為30 ℃、濕度為90%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)46 h，于制曲12 h進(jìn)行第1次翻曲，于制曲19 h進(jìn)行第2次翻曲。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

選取蝦殼粉碎程度、原料配比、潤水量、蒸料時間、制曲時間、翻曲次數(shù)和接種量7個單因素，根據(jù)表1中的因素水平和1.3.2的方法制曲，觀察成曲的感官質(zhì)量并測定成曲的理化指標(biāo)?？疾煲陨?個單因素對成曲中感官質(zhì)量、蛋白酶活力、糖化酶活力、水分含量、孢子數(shù)的影響。

表1 單因素試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of single factor experiment

1.3.4 制曲工藝條件優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，設(shè)計(jì)三因素三水平正交試驗(yàn)。

1.3.5 測定方法

水分含量按照GB/T 22906.3-2008 中烘箱干燥法測定，蛋白酶活力按照QB/T 1803-1993中福林酚法測定，糖化酶活力按照QB/T 1803-1993 中方法測定，孢子數(shù)按照SB/T 10315-1999中方法測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 蝦殼粉碎程度對成曲品質(zhì)的影響

蝦殼粉碎程度對成曲感官質(zhì)量的影響見表2。

表2 蝦殼粉碎程度對成曲感官質(zhì)量的影響Table 2 Effect of shrimp shell crushing degree on sensory quality of finished koji

圖1 蝦殼粉碎程度對成曲中水分含量、孢子數(shù)、中性蛋白酶活力和糖化酶活力的影響Fig.1 Effect of shrimp shell crushing degree on moisture content, spores number, neutral protease activity and glucoamylase activity of finished koji

由表2和圖1可知，隨著粉碎程度的增加，成曲中孢子數(shù)、中性蛋白酶活力和糖化酶活力降低，水分含量增加。這可能是隨著原料蝦殼進(jìn)一步粉碎，潤水后易發(fā)生黏連、結(jié)塊，在蒸料時會出現(xiàn)蒸料不均的現(xiàn)象，導(dǎo)致制曲時不通風(fēng)和感染雜菌，抑制米曲霉的生長，從而影響酶系的分泌。當(dāng)蝦殼粉碎至約蠶豆大小時，其成曲中中性蛋白酶活力和糖化酶活力較高，且成曲中孢子數(shù)最高。原料蝦殼需適度粉碎，當(dāng)蝦殼不粉碎時，米曲霉的生長繁殖面積變小，進(jìn)而酶活降低，適當(dāng)粉碎后的蝦殼制曲有利于米曲霉的生長發(fā)育，因此粉碎大小以蠶豆大小為宜。

2.2 原料配比對成曲品質(zhì)的影響

蝦殼和面粉配比對曲料感官質(zhì)量的影響見表3。

表3 蝦殼和面粉配比對曲料感官質(zhì)量的影響Table 3 Effect of the ratio of shrimp shells to flour on sensory quality of finished koji

由表3和圖2可知，隨著蝦殼和面粉比例的減少，成曲中蛋白酶活力、糖化酶活力和孢子數(shù)量逐漸降低，水分含量逐漸上升。中性蛋白酶活力和糖化酶活力在原配料比(蝦殼∶面粉)為10∶4時達(dá)到最大值，分別為2047.6，2018.3 U/g，且在該條件下曲料中的米曲霉孢子數(shù)最高和水分含量最低，說明該狀態(tài)下，米曲霉生長情況較好，從曲料外觀也可以看出，成曲表面孢子濃密，均勻叢生。在制曲過程中，蝦殼和面粉提供米曲霉生長所需的營養(yǎng)成分，面粉提供米曲霉生長所需的碳源，隨著面粉原料的減少，米曲霉的生長受到影響，只有在適度的原料比中，有充足的碳源和氮源米曲霉才能迅速增長繁殖，有利于成曲中酶系的形成，因此原料配比(蝦殼∶面粉)以10∶4為宜。

圖2 蝦殼和面粉配比對成曲中水分含量、孢子數(shù)、中性蛋白酶活力和糖化酶活力的影響Fig.2 Effect of the ratio of shrimp shells to flour on moisture content, spores number, neutral protease activity and glucoamylase activity of finished koji

2.3 潤水量對成曲品質(zhì)的影響

潤水量對曲料感官質(zhì)量的影響見表4。

表4 潤水量對曲料感官質(zhì)量的影響Table 4 Effect of water additive amount on sensory quality of finished koji

續(xù) 表

由表4和圖3可知，成曲曲料中的孢子數(shù)、中性蛋白酶活力、糖化酶活力隨著潤水量的增加先上升后降低。這是因?yàn)檫m當(dāng)潤水使原料中的蛋白質(zhì)和淀粉在蒸料時變性和糊化，有利于米曲霉吸收營養(yǎng)物質(zhì)，并提供米曲霉生長所需的水分。李幼筠等報道潤水量過多，容易導(dǎo)致原料中的蛋白質(zhì)在蒸料時過度變性，從而使曲料結(jié)塊，不通風(fēng)且高濕環(huán)境下易感染球菌，消耗淀粉原料，同時部分蛋白質(zhì)原料被分解，產(chǎn)生氨味等不良?xì)馕叮绊懨浊沟纳L。成曲中孢子數(shù)和糖化酶活力在潤水量為80%時均達(dá)到最大值，分別為5.95×108CFU/g和741.504 U/g值，對此時曲料表面孢子濃密均勻叢生，有濃郁曲香。在潤水量大于80%時，成曲中的孢子數(shù)、中性蛋白酶活力、糖化酶活力均呈下降趨勢。因此，潤水量以80%為宜。

圖3 潤水量對成曲中水分含量、孢子數(shù)、中性蛋白酶活力和糖化酶活力的影響Fig.3 Effect of water additive amount on moisture content, spores number, neutral protease activity and glucoamylase activity of finished koji

2.4 蒸料時間對成曲品質(zhì)的影響

蒸料時間對曲料感官質(zhì)量的影響見表5。

表5 蒸料時間對曲料感官質(zhì)量的影響Table 5 Effect of materials steaming time on sensory quality of finished koji

由表5和圖4可知，中性蛋白酶活力隨著蒸料時間的增加變化無顯著性差異(p>0.05)，成曲中孢子數(shù)和糖化酶活力在蒸料20 min時均達(dá)到最大值，分別為5.12×108CFU/g和755.7 U/g。當(dāng)蒸料5 min時，原料中蛋白質(zhì)開始變性，隨著蒸料時間的增長，適度變性的蛋白質(zhì)增多，蛋白質(zhì)的適度變性有利于米曲霉的生長和酶系的產(chǎn)生，蒸料時間過長時，原料中蛋白質(zhì)發(fā)生過度變性[11]，形成不能被酶解的結(jié)構(gòu)，同時糖類和一些含氨化合物發(fā)生褐色反應(yīng)生成色素，影響米曲霉的生長繁殖，因此當(dāng)蒸料時間達(dá)到20 min以后，糖化酶活力、中性蛋白酶活力、孢子數(shù)均下降。綜上，蒸料時間以20 min為宜。

2.5 制曲時間對成曲品質(zhì)的影響

制曲時間對曲料感官質(zhì)量的影響見表6。

表6 制曲時間對曲料感官質(zhì)量的影響Table 6 Effect of koji-making time on sensoryquality of finished koji

由表6和圖5可知，在制曲34～46 h期間，成曲中的孢子數(shù)和中性蛋白酶活力、糖化酶活力均在上升。這是因?yàn)榇藭r米曲霉處于菌絲繁殖期，米曲霉生長分為4個周期，其酶系的分泌主要是在菌絲繁殖期，故隨著制曲時間的增長，酶活升高，酶系越完全。而制曲40 h后米曲霉處于孢子著生期，菌絲開始生產(chǎn)孢子，故在制曲40 h后成曲中的蛋白酶活力上升緩慢。由圖5可知，在制曲58 h時，成曲中糖化酶活力達(dá)到最大值1077.5 U/g，這可能是部分菌絲在30 h開始產(chǎn)生孢子，這些孢子在50 h時二次萌發(fā)，故制曲時間增長，孢子數(shù)也隨之增多。在制曲46 h時后成曲中蛋白酶活力增長緩慢，糖化酶活力下降，從經(jīng)濟(jì)及防止碳水化合物損失的角度來看，隨著制曲時間的增長，曲料中的營養(yǎng)物質(zhì)損失越多，因此制曲時間以46 h為宜。

2.6 翻曲次數(shù)對成曲品質(zhì)的影響

翻曲次數(shù)對曲料感官質(zhì)量的影響見表7。

表7 翻曲次數(shù)對曲料感官質(zhì)量的影響Table 7 Effect of koji stirring times on sensory quality of finished koji

由表7和圖6可知，成曲中孢子數(shù)隨著翻曲次數(shù)的增加而下降，中性蛋白酶活力和糖化酶活力均在翻曲2次時達(dá)到最大值2005.1，747.2 U/g，水分含量在翻曲2次時達(dá)到最小值。這是因?yàn)樵谥魄^程中，米曲霉菌絲不斷生長，曲料容易結(jié)塊，從而導(dǎo)致品溫升高，容易出現(xiàn)燒曲現(xiàn)象，影響曲霉的生長，菌絲減少，影響酶活[12]，此時應(yīng)該進(jìn)行翻曲，將曲料打碎翻動，使曲料疏松。翻曲次數(shù)過多，雖然可以使曲料疏松，氧氣充足，但曲料沾染雜菌的幾率也隨之增大，會與米曲霉?fàn)帄Z生長空間，從而影響米曲霉的生長。因此，翻曲次數(shù)以2次為宜。

圖6 翻曲次數(shù)對成曲中水分含量、孢子數(shù)、中性蛋白酶活力和糖化酶活力的影響Fig.6 Effect of koji stirring times on moisture content,spores number, neutral protease activity and glucoamylase activity of finished koji

2.7 接種量對成曲品質(zhì)的影響

接種量對曲料感官質(zhì)量的影響見表8。

表8 接種量對曲料感官質(zhì)量的影響Table 8 Effect of inoculation amount on sensory quality of finished koji

由表8和圖7可知，糖化酶隨著接種量的增加而增加，在接種量為1.5%時達(dá)到最大值847.7 U/g。水分含量隨著接種量的增加而降低。中性蛋白酶活力和孢子數(shù)隨著接種量增加無顯著性差異(p>0.05)。接種量在1%、1.5%、2%時，米曲霉長勢很好，曲料表面都長滿了嫩綠色的孢子，有濃厚的曲香味，接種量為0.5%時，米曲霉長勢稍差。因此，接種量以1.5%為宜。

圖7 接種量對成曲中水分含量、孢子數(shù)、中性蛋白酶活力和糖化酶活力的影響Fig.7 Effect of inoculation amount on moisture content, spores number, neutral protease activity and glucoamylase activity of finished koji

2.8 優(yōu)化制曲工藝條件的L9(33)正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇原料配比、潤水量、制曲時間三因素的三水平設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，測定成曲中的孢子數(shù)、中性蛋白酶活力、糖化酶活力，結(jié)果見表9。

表9 優(yōu)化制曲工藝條件的L9(33)正交試驗(yàn)結(jié)果Table 9 L9(33) orthogonal test results for optimization of koji-making conditions

由表9可知，各因素對中性蛋白酶活力的影響大小依次為B>C>A，最優(yōu)組合為A3B3C1;各因素對糖化酶活力的影響大小依次為A>B>C，最優(yōu)組合為A3B1C1；各因素對中孢子數(shù)的影響大小依次為A>B>C，最優(yōu)組合為A3B2C2。由正交表可知，當(dāng)蝦殼和面粉比例為10∶5，制曲時間為46 h時糖化酶活力最高、中性蛋白酶活力較高，當(dāng)潤水量80%時孢子數(shù)最高且糖化酶活力、中性蛋白酶活力較高。綜上所述，最優(yōu)方案為A3B2C1,即蝦殼和面粉比例10∶5，潤水量80%，制曲時間46 h為最優(yōu)制曲工藝。

3 結(jié)論

采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)和L9(33)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對蝦殼醬油的制曲工藝進(jìn)行了研究，確定最優(yōu)的工藝條件為：蝦殼粉碎至約蠶豆大小，蝦殼面粉配比10∶5，潤水量80%，蒸料時間20 min，制曲46 h，翻曲2次，接種量1.5%。按照最優(yōu)工藝條件進(jìn)行蝦殼醬油的制曲，得到的成曲中蛋白酶活力達(dá)到了2160.8 U/g，糖化酶活力達(dá)到810.1 U/g，孢子數(shù)達(dá)到8.9×108CFU/g，成曲表面孢子濃密，均勻叢生，具有濃郁曲香，滿足醬油中成曲的質(zhì)量要求。