蔣再學(xué) 陸小梅

（東莞市兒科研究所 廣東 東莞 523325）

手足口?。℉FMD）是兒童常見(jiàn)傳染病，重癥者可以引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)損傷、甚至死亡[1-3]。研究表明柯薩奇病毒A組16型(CA16)和腸道病毒71型(EV71)是導(dǎo)致HFMD的主要致病原[4-5]。疫苗的使用可以有效的防控病毒的傳播,目前臨床使用的EV71滅活疫苗需要多次免疫且存在一定的安全隱患，因此研制免疫保護(hù)周期長(zhǎng)且安全有效的EV71疫苗具有重要意義。

近年來(lái)基于甲病毒等正鏈RNA病毒的RNA復(fù)制子作為疫苗載體已有較多研究，這種RNA復(fù)制子載體具有無(wú)DNA整合、高表達(dá)效率等優(yōu)點(diǎn)[6-7]。RNA復(fù)制子載體包含病毒基因組5’和3’末端的非編碼區(qū)、非結(jié)構(gòu)蛋白基因編碼區(qū)，其結(jié)構(gòu)區(qū)被外源基因所取代，外源基因由病毒基因組啟動(dòng)子控制表達(dá)。表達(dá)外源抗原的RNA復(fù)制子可有3種形式：①質(zhì)粒，由細(xì)胞RNA聚合酶體內(nèi)轉(zhuǎn)錄成復(fù)制子RNA；②裸RNA；③病毒顆粒，這種帶有病毒樣顆粒的復(fù)制子RNA在非互補(bǔ)細(xì)胞中由于缺乏病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，其基因雖然可以復(fù)制，但不能包裝產(chǎn)生感染性子代，是一種包裝缺陷型病毒。

1.資料與方法

1.1 材料

Vero及293T細(xì)胞購(gòu)自于美國(guó)ATCC；常用的細(xì)胞培養(yǎng)試劑及耗材購(gòu)買(mǎi)于某公司；常用的分子生物學(xué)操作試劑盒購(gòu)買(mǎi)于北京某公司；RT-PCR擴(kuò)增酶，熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒等購(gòu)買(mǎi)于大連某科技有限公司；常用的限制性?xún)?nèi)切酶，T4DNA連接酶購(gòu)買(mǎi)于某公司；HRP-羊抗兔IgG，EV71 VP2多克隆抗體購(gòu)自深圳某公司；嘌呤霉素購(gòu)自某公司。

1.2 研究方法

1.2.1 重組慢病毒載體的構(gòu)建 根據(jù)EV71-08-02 (GenBank：FJ360545)的基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增EV71 VP4-VP2-VP3的引物。

FVP4-2-3：5'-CGACGCGTATGGGTTCGCAAGTGTCTACACAGC-3'

RVP4-2-3：5'-ATTTGCGGCCGCCTGGATGGTGCCCGTCTGCA-3'

上下游劃線(xiàn)處分別為MluI以及NotI限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。

按照分子生物學(xué)的方法擴(kuò)增目的基因及克隆至慢病毒載體pLV-puro，構(gòu)建pLV-EV71 VP4-VP2-VP3。

1.2.2 重組慢病毒包裝及細(xì)胞感染 首先將pLV-EV71 VP4-VP2-VP3質(zhì)粒及輔助質(zhì)粒pH1和pH2轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中獲得重組慢病毒，不含有目的片段的空載體為對(duì)照并命名為NC組。

其次將構(gòu)建好的慢病毒感染Vero細(xì)胞，使用10μg/mL嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，使用熒光顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞狀態(tài)。

1.2.3 穩(wěn)定轉(zhuǎn)細(xì)胞系的熒光定量PCR檢測(cè) 根據(jù)EV71 VP4-VP2-VP3的序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR檢測(cè)引物，引物序列為：

qfEV71：5'-TGGCATCCCAATATCACAGT-3'；

qrEV71：5'-GGTTCAAGGCAGAATCAAA-3'

提取細(xì)胞總RNA并計(jì)算1 μg總RNA需要的體積，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用qPCR試劑盒以及熒光定量PCR檢測(cè)引物對(duì)cDNA進(jìn)行熒光定量檢測(cè)。

1.2.4 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的Western Blot鑒定 使用5×蛋白上樣緩沖液處理蛋白后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將電泳后的凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。分別使用EV71 VP2以及HRP-羊抗兔IgG作為一抗及二抗反應(yīng)液進(jìn)行檢測(cè)，使用DAB顯色試劑盒顯色。

2.結(jié)果

2.1 重組慢病毒質(zhì)粒的構(gòu)建

FVP4-2-3，RVP4-2-3引物對(duì)EV71 RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，獲得EV71 VP4-VP2-VP3基因片段。結(jié)果表明在1700 bp左右呈現(xiàn)特異性條帶。結(jié)果如圖1所示。

圖1 EV71 VP4-VP2-VP3基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 表達(dá)EV71 VP4-VP2-VP3蛋白的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系構(gòu)建結(jié)果

分別對(duì)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞進(jìn)行qPCR及Western Blot檢測(cè)。經(jīng)過(guò)篩選的細(xì)胞培養(yǎng)48h后觀(guān)察細(xì)胞的形態(tài)如圖2所示，qPCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明表達(dá)EV71 VP4-VP2-VP3的Vero細(xì)胞的基因拷貝數(shù)顯著高于其他兩組，結(jié)果如圖3所示。Western Blot檢測(cè)結(jié)果表明，EV71 VP4-VP2-VP3在Vero細(xì)胞內(nèi)獲得表達(dá)結(jié)果如圖4所示。

圖2 細(xì)胞形態(tài)圖

圖3 熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

圖4 Western Blot檢測(cè)結(jié)果

3.討論

HFMD長(zhǎng)期危害兒童的健康[8]。雖然已有EV71滅活疫苗用于防控HFMD，然而滅活疫苗存在許多缺點(diǎn)。弱毒疫苗雖然具有良好的免疫原性，然而有關(guān)EV71相關(guān)毒力基因的研究還需要進(jìn)一步的解決。近些年假病毒包裝體系的建立為研發(fā)安全、有效的疫苗提供新思路。有關(guān)腸道病毒假病毒系統(tǒng)的研究還未見(jiàn)報(bào)道，這可能與缺乏相應(yīng)互補(bǔ)細(xì)胞系的研究有關(guān)。

本研究基于EV71病毒的分子結(jié)構(gòu)，將EV71的部分衣殼蛋白基因VP4-VP2-VP3克隆至慢病毒表達(dá)載體，通過(guò)感染的方法構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)EV71 VP4-VP2-VP3的Vero細(xì)胞系。有研究表明EV71的主要毒力基因位點(diǎn)位于其基因組的非編碼區(qū)[9]，而EV71的主要抗原片段或中和抗原表位則主要位于VP1蛋白[10]。因此本研究所構(gòu)建的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系從理論上并無(wú)致病性。穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的圖片驗(yàn)證了這設(shè)想。

4.結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了表達(dá)EV71 VP4-VP2-VP3的慢病毒表達(dá)系統(tǒng)，通過(guò)篩選獲得了一株能夠穩(wěn)定表達(dá)EV71 VP4-VP2-VP3基因的Vero細(xì)胞株，為將來(lái)研制EV71新型疫苗奠定基礎(chǔ)。