謝銀丹，趙添玉，許 巖，任皓威，安晶晶，劉 寧*

（東北農業(yè)大學食品學院，乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150000）

三唑酮是一種廣譜抗真菌農藥，化學名稱為1-(4-氯苯氧基)-3,3-二甲基-1-(1H-1,2,4-三唑-l-基)-α-丁酮，它被廣泛應用于多種作物的病害防治[1-3]。但是該農藥可能在農作物[4]、土壤[5]和水體[6]中殘留，給生物安全與人類健康帶來負面的影響[7]。三唑酮可以通過職業(yè)性接觸、日常接觸和食物經呼吸系統(tǒng)、皮膚和消化道到達人體內。研究發(fā)現(xiàn)，三唑酮具有神經毒性[8]、胚胎發(fā)育毒性[9]和內分泌毒性[10]，并具有致癌和致畸[11-12]作用。Al-Sarar等[13]用中國倉鼠卵巢細胞系體外實驗證明三唑酮的細胞毒性具有時間依賴性；劉少穎[14]所做急性毒性實驗結果顯示，三唑酮對斑馬魚胚胎的半致死濃度為12.2 μg/mL，表明三唑酮對斑馬魚胚胎具低毒性。孫瑞娟等[15]進行的人肝細胞實驗結果表明，當三唑酮質量濃度高于20.998 μg/mL時會顯著抑制細胞的增殖，隨著質量濃度的增大毒性逐漸增大。目前有關三唑酮的研究大多著重于水生生物，對哺乳動物的研究較少，三唑酮對SD大鼠骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）影響的研究鮮見報道。BMSCs作為成骨細胞和脂肪細胞共同的前體細胞，對于維系二者之間的均衡起著至關重要的作用，在維持正常的骨代謝均衡方面也具有十分重要的意義。乳鐵蛋白（lactoferrin，Lf）是一種由上皮細胞分泌產生分子質量約為80 kDa的鐵結合糖蛋白，普遍存在于哺乳動物的乳汁中，其理化性質獨特，具有抑菌、抗病毒、抗氧化、免疫調節(jié)、調節(jié)鐵離子的吸收等諸多生物學功能。已有研究證明乳鐵蛋白具有促進成骨細胞增殖的作用[16-19]，本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)Lf及其消化產物都能促進BMSCs向成骨分化[20]。BMSCs是骨重建中新骨形成的主要來源[21]，在三唑酮作用下，BMSCs發(fā)生損傷，Lf修復損傷后的BMSCs活性及增殖能力成為關注的熱點之一。

本實驗利用三唑酮作用于骨髓間充質干細胞建立BMSCs損傷模型，研究Lf對三唑酮損傷BMSCs 的修復作用，以期為今后三唑酮殘留對BMSCs定向分化的影響研究提供量化參考，也為Lf的深度開發(fā)和調控個體生長發(fā)育提供新的理論參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

骨髓間充質干細胞（提取自2 周齡雄性SD大鼠）北京維通利華實驗動物技術有限公司。

三唑酮 中國農業(yè)科學院農產品加工所；乳鐵蛋白新西蘭Westland Milk Products公司；DMEM-H培養(yǎng)基、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS） 美國Gibco公司；CCK-8細胞增殖-毒性檢測試劑盒 北京蘭杰柯科技有限公司；大鼠堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒、大鼠骨鈣素（osteocalcin，OCN）酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒 上海江萊生物科技有限公司；茜素紅染液、油紅O染液 廣州賽業(yè)生物科技有限公司；總RNA提取試劑盒 北京天根生化科技有限公司；反轉錄試劑盒、反轉錄實時熒光定量聚合酶鏈式反應（reverse transcription quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-qPCR）試劑盒 北京寶日醫(yī)生物技術有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

HF-90 CO2細胞培養(yǎng)箱 美國力康公司；HVD-1320超凈工作臺 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；JEM-1200EX電子顯微鏡 日本日立公司；Sorvall Legeng Micro 17R高速冷凍離心機 美國Thermo Scientific公司；Model 680酶標儀 美國Bio-Rad公司；Step One PlusTM熒光定量PCR儀 美國Life Technologies公司；DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋 天津泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)

SD大鼠骨髓間充質干細胞的提取培養(yǎng)參考宮宇等[22]的細胞培養(yǎng)方法。

1.3.2 BMSCs損傷模型的建立

取對數(shù)生長期的BMSCs懸液接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，細胞接種密度為6×103個/孔，貼壁培養(yǎng)24 h。棄培養(yǎng)液，每孔加入100 μL含有三唑酮的完全培養(yǎng)液，三唑酮的質量濃度分別為0.01、0.1、1、5、10、20 μg/mL，培養(yǎng)時間分別為1、3、5、7 d。設調零組（完全培養(yǎng)液）、對照組（BMSCs＋完全培養(yǎng)液）、實驗組（BMSCs＋含三唑酮的完全培養(yǎng)液）。棄去培養(yǎng)液，每孔加入含10% CCK-8的培養(yǎng)液100 μL，培養(yǎng)箱中孵育1 h，用酶標儀在450 nm波長處測定其OD值，細胞的增殖活性以細胞存活率表示，按下式計算。

1.3.3 Lf對BMSCs增殖的影響

采用CCK-8法測定細胞存活率[23-24]。取對數(shù)生長期的BMSCs懸液接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，BMSCs貼壁生長24 h后，加入100 μL含有Lf的完全培養(yǎng)液，Lf的質量濃度分別為10、20、50、100、150、200 μg/mL，培養(yǎng)時間為1、3、5、7 d。設調零組（完全培養(yǎng)液）、對照組（BMSCs＋完全培養(yǎng)液）、實驗組（BMSCs＋含Lf的完全培養(yǎng)液）。棄去培養(yǎng)液，每孔加入含10% CCK-8的培養(yǎng)液100 μL，培養(yǎng)箱中孵育1 h，用酶標儀在450 nm波長處測定其OD值，按1.3.2節(jié)公式計算細胞存活率。

1.3.4 Lf對損傷BMSCs存活率的影響

取對數(shù)生長期的BMSCs懸液接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，BMSCs貼壁生長24 h后，加入100 μL含有20 μg/mL三唑酮的完全培養(yǎng)液，損傷培養(yǎng)3 d。棄去培養(yǎng)液，加入100 μL含有100 μg/mL Lf的完全培養(yǎng)液，作用時間分別為3、5、7 d。實驗設置調零組（完全培養(yǎng)液）、空白對照組（BMSCs＋完全培養(yǎng)液）、三唑酮損傷組（BMSCs＋20 μg/mL三唑酮）、Lf修復組（BMSCs＋20 μg/mL三唑酮＋100 μg/mL Lf）。棄去培養(yǎng)液，每孔加入含10% CCK-8的培養(yǎng)液100 μL，培養(yǎng)箱中孵育1 h，用酶標儀在450 nm波長處測定其OD值，按1.3.2節(jié)公式計算細胞存活率。

1.3.5 損傷BMSCs成骨分化過程中ALP質量濃度的檢測

取對數(shù)生長期的P3代融合度為80%的BMSCs接種于6 孔板中，每孔2 mL細胞懸液，細胞接種密度為4×104個/mL，放置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。細胞融合度達到90%以上時，加入2 mL含藥成骨誘導培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每3 d換一次含藥誘導液。實驗設置空白對照組、三唑酮組（20 μg/mL三唑酮）、Lf組（100 μg/mL Lf）、Lf修復組（20 μg/mL三唑酮＋100 μg/mL Lf）。成骨誘導分化時間共21 d，第7、14、21天檢測ALP質量濃度。按照大鼠ALP測定試劑盒說明書步驟進行ALP質量濃度的測定。

1.3.6 損傷BMSCs成骨分化過程中OCN質量濃度的檢測

實驗方法同1.3.5節(jié)，按照大鼠過程中骨鈣素測定試劑盒說明書步驟進行OCN質量濃度的測定。

1.3.7 成骨分化礦化結節(jié)染色及觀察

取對數(shù)生長期的P3代融合度為80%的BMSCs接種于6 孔板中，每孔2 mL細胞懸液，細胞接種密度為4×104個/mL，放置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。細胞長滿后，加入2 mL含藥成骨誘導培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每3 d換一次含藥誘導液。實驗設置空白對照組、三唑酮組（20 μg/mL三唑酮）、Lf組（100 μg/mL Lf）、Lf修復組（20 μg/mL三唑酮＋100 μg/mL Lf）。成骨誘導分化時間共21 d，誘導分化結束后用茜素紅進行染色，顯微鏡下觀察。

1.3.8 成脂分化油紅O染色及觀察

取對數(shù)生長期的P3代融合度為80%的BMSCs接種于6 孔板中，每孔2 mL細胞懸液，細胞接種密度為4×104個/mL，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。細胞融合度達到90%以上時，加入2 mL含藥成脂誘導培養(yǎng)基A液培養(yǎng)3 d，吸去6 孔板中的A液，加入2 mL含藥成脂誘導培養(yǎng)基B液，24 h后，吸去B液，換回A液進行誘導，A液和B液交替作用4 次后，用B液維持培養(yǎng)5 d，B液維持培養(yǎng)期間，每隔2 d換一次新鮮B液。實驗設置空白對照組、三唑酮組（20 μg/mL三唑酮）、Lf組（100 μg/mL Lf）、Lf修復組（20 μg/mL三唑酮＋100 μg/mL Lf）。成脂誘導分化時間共21 d，誘導分化結束后用油紅O進行染色，顯微鏡下觀察。

1.3.9 RT-qPCR分析成骨、成脂基因表達變化

取對數(shù)生長期的P3代融合度為80%的BMSCs接種于6 孔板中，每孔2 mL細胞懸液，細胞接種密度為4×104個/mL，放置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。實驗設置空白對照組、三唑酮組（20 μg/mL三唑酮）、Lf組（100 μg/mL Lf）、Lf修復組（20 μg/mL三唑酮＋100 μg/mL Lf）。細胞融合度達到90%以上時進行誘導分化。

成骨分化誘導：BMSCs培養(yǎng)于6 孔板中，完全培養(yǎng)基調整細胞融合度達到90%以上，加入2 mL含藥成骨誘導培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每3 d換一次含藥誘導液。

成脂分化誘導：BMSCs培養(yǎng)于6 孔板中，完全培養(yǎng)基調整細胞融合度達到90%以上，加入2 mL含藥成脂誘導培養(yǎng)基A液培養(yǎng)3 d，吸走6 孔板中的A液，加入2 mL含藥成脂誘導培養(yǎng)基B液，24 h后，吸走B液，換回A液進行誘導，A液和B液交替作用4 次后，用B液維持5 d，B液維持培養(yǎng)期間，每隔2 d換一次新鮮B液。

收集細胞至無RNA酶的離心管中，按照RNAprep Pure培養(yǎng)細胞/細菌總RNA提取試劑盒說明書的方法去除基因組DNA，提取總RNA，然后按照反轉錄試劑盒說明書的方法合成cDNA，最后進行RT-qPCR，反應條件：預變性95 ℃、30 s；變性95 ℃、5 s，延伸60 ℃、30 s，40 個循環(huán)；熔解曲線條件（95 ℃、15 s；60 ℃、60 s；95 ℃、15 s）。成骨分化及成脂分化基因引物序列分別見表1、2。

表1 RT-qPCR成骨分化方向基因引物Table 1 Primer sequences for osteogeneic differentiation genes used in RT-qPCR

表2 RT-qPCR成脂分化方向基因引物Table 2 Primer sequences for adipogenic differentiation primers used in RT-qPCR

1.4 數(shù)據統(tǒng)計與分析

所有實驗均重復3 次，結果以平均值±標準差表示。采用Excel 2007和Origin 85軟件作圖。采用SPSS 22軟件對數(shù)據進行統(tǒng)計分析，以單因素方差分析和Duncan’s法比較數(shù)據間差異的顯著性，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 三唑酮對BMSCs存活率的影響

圖1 三唑酮對BMSCs存活率的影響Fig. 1 Effect of triadimefon on the survival rate of BMSCs

由圖1可知，與對照組（0 μg/mL）比較，采用不同質量濃度（0.01、0.1、1、5、10、20 μg/mL）的三唑酮處理1 d時，20 μg/mL三唑酮能對BMSCs造成損傷，其余較低質量濃度三唑酮會不同程度促進BMSCs增殖；當處理時間延長至3、5、7 d時，不同質量濃度的三唑酮均能對BMSCs造成顯著損傷，且三唑酮對BMSCs的損傷作用在所選范圍內呈現(xiàn)質量濃度-效應關系和時間-效應關系。根據三唑酮造成的細胞存活率的半數(shù)致死量，以及考慮到損傷時間的長短，本研究選取20 μg/mL的三唑酮處理3 d作為構建BMSCs損傷模型的條件，此條件下的細胞存活率為55.41%。

2.2 Lf對BMSCs增殖的影響

由圖2可知，與對照組（0 μg/mL）比較，采用不同質量濃度的Lf處理BMSCs 1、3、5、7 d，均能不同程度地提高BMSCs的存活率。隨著作用時間的延長，Lf對BMSCs的增殖作用顯著增加，5 d時作用效果最明顯；這說明Lf在10～200 μg/mL范圍內對BMSCs無毒性作用且能促進其增殖，其中100 μg/mL的Lf作用最顯著。

圖2 Lf對BMSCs存活率的影響Fig. 2 Effect of Lf on the survival rate of BMSCs

2.3 Lf對損傷BMSCs存活率的影響

圖3 Lf對三唑酮損傷BMSCs增殖的影響Fig. 3 Effect of Lf on the proliferation of BMSCs treated with triadimefon

由圖3可知，與空白對照組比較，三唑酮損傷處理不同時間后，BMSCs存活率均顯著下降（P＜0.05）；對損傷模型加入Lf處理不同時間，結果顯示均能顯著提高BMSCs存活率（P＜0.05）。

2.4 Lf對損傷BMSCs成骨分化過程中分泌ALP的影響

表3 成骨誘導不同時間ALP質量濃度的比較Table 3 ALP activity at different times of osteogenic induction

ALP作為骨形成和骨轉換的一個關鍵標志性酶，1923年被首次發(fā)現(xiàn)，作為BMSCs成骨分化初期的標志性酶，ALP在BMSCs增殖末期時質量濃度開始增加，在礦化期前期階段質量濃度達到最高，ALP質量濃度在一定程度上顯示出細胞的成骨分化能力[25]。由表3可知，與空白對照組相比，三唑酮組誘導處理后，ALP質量濃度顯著降低（P＜0.05）；Lf組和Lf修復組的ALP質量濃度顯著增加（P＜0.05）。由此可知，Lf可有效修復三唑酮對細胞成骨分化造成的損傷。

2.5 Lf對損傷BMSCs成骨分化過程中分泌OCN的影響

表4 成骨誘導不同時間OCN質量濃度的比較Table 4 OCN contents at different times of osteogenic induction

OCN是成骨分化特異性表達的胞外基質蛋白，可以結合鈣、磷離子形成礦化基質，作為分化末期特異性標志物，能調控骨礦物沉積以及轉移、促進成骨分化成熟[26]。因OCN僅在成骨細胞內表達，故可以作為特異性指標來評價BMSCs的成骨分化能力。由表4可知，與空白對照組相比，三唑酮組誘導處理后，OCN質量濃度顯著降低（P＜0.05）；Lf組和Lf修復組的OCN質量濃度顯著增加（P＜0.05）。由此可知，三唑酮會對細胞向成骨分化造成一定損傷，而Lf可有效修復這種損傷。

2.6 Lf對損傷BMSCs成骨誘導21 d后礦化結節(jié)形成的影響

礦化結節(jié)的形成是體外誘導BMSCs成骨分化能力最直接的表現(xiàn)，是BMSCs定向成骨分化的最后階段。BMSCs在成骨誘導分化后細胞外基質具有大量的鈣沉積，是分化為骨的標志，茜素紅可以和礦化結節(jié)中的鈣結合形成紅色的復合物。

圖4 成骨誘導21 d后茜素紅染色結果（×100）Fig. 4 Alizarin red staining results after 21 days of osteogenic induction (× 100)

由圖4可以看出，與空白對照組相比，三唑酮組細胞形狀仍為長梭形，極少有礦化結節(jié)形成，說明三唑酮對BMSCs向成骨分化造成了損傷；Lf組形成的礦化結節(jié)最多，說明Lf對BMSCs向成骨方向進行分化具有促進作用；Lf修復組和三唑酮組相比礦化結節(jié)數(shù)量更多，成骨分化較為明顯，說明Lf可修復三唑酮對BMSCs向成骨分化造成的損傷。

2.7 Lf對損傷BMSCs成脂誘導21 d后脂滴形成的影響

圖5 成脂誘導21 d后油紅O染色結果（×100）Fig. 5 Oil red O staining results after 21 days of adipogenic induction (× 100)

由圖5可以看出，與空白對照組相比，三唑酮組出現(xiàn)脂滴數(shù)量最多，說明三唑酮會使BMSCs向成脂方向進行分化；Lf組脂滴數(shù)量最少，這說明Lf能抑制脂滴生成；Lf修復組脂滴數(shù)量少于三唑酮組，說明Lf對三唑酮促進BMSCs向成脂分化的進程有拮抗作用。

2.8 成骨誘導21 d后成骨分化基因的表達

表5 成骨誘導21 d BMSCs成骨分化基因的表達Table 5 Expression of osteogenic differentiation genes in BMSCs after osteogenic induction for 21 days

由表5可知，與空白對照組比較，Lf處理后成骨分化中關鍵基因的表達水平都有所提高，Lf組ALP、BMP-2、Osteorix、Col I、Runx2、OCN基因表達分別上調52%、14%、50%、18%、70%、186%；Lf修復組上述基因分別上調28%、3%、50%、14%、17%、52%；三唑酮組上述基因分別下調24%、42%、50%、57%、50%、12%。Lf組成骨分化主要基因的上調比例大于Lf修復組。

2.9 成脂誘導21 d后成脂分化基因的表達

由表6可知，與空白對照組比較，Lf處理后都下調了成脂分化中關鍵基因的表達水平，Lf組PPAR-gamma、LPL、FABP4基因分別下調23%、26%、10%；Lf修復組上述基因分別下調4%、12%、0.5%；三唑酮組上述基因分別上調8%、25%、21%。

表6 成脂誘導21 d BMSCs成脂分化基因的表達Table 6 Expression of adipogenic differentiation genes in BMSCs after adipogenic induction for 21 days

3 討 論

本研究選擇BMSCs作為細胞模型研究三唑酮對細胞增殖分化損傷及Lf對此損傷的修復作用，選用6 個三唑酮質量濃度梯度（0.01、0.1、1、5、10、20 μg/mL）作用于BMSCs，暴露時間1 d時，最高質量濃度（20 μg/mL）三唑酮能對BMSCs造成損傷，其余較低質量濃度三唑酮會不同程度促進BMSCs增殖；當暴露時間延長至3、5、7 d時，不同質量濃度的三唑酮均能對BMSCs造成顯著的損傷，細胞存活率隨著暴露時間顯著降低，說明三唑酮在所選劑量和時間范圍內可抑制BMSCs增殖活性，對BMSCs具有損傷作用。其原因可能是細胞暴露于三唑酮導致活性氧的產生，使細胞膜的結構和功能遭到破壞[27]。三唑酮細胞毒性作用隨暴露時間的逐漸增強，可能是由于通過酶的作用使三唑酮產生了毒性作用更強的代謝物三唑醇[28]。Lf可能對這種損傷具有修復作用，所以選用6 個Lf質量濃度梯度（10、20、50、100、150、200 μg/mL）作用于BMSCs后計算細胞存活率，結果表明，Lf對BMSCs無毒性作用且能促進BMSCs的增殖，其中100 μg/mL的Lf作用最顯著。分析Lf作用于BMSCs損傷模型后的細胞存活率、ALP質量濃度、OCN質量濃度、茜素紅染色、油紅O染色和定向分化基因表達變化，結果表明：三唑酮損傷BMSCs后，細胞存活率顯著降低，細胞ALP、OCN質量濃度顯著降低，礦化結節(jié)形成極少，脂滴數(shù)量增多，成骨分化相關基因的相對表達顯著降低，成脂分化相關基因的相對表達顯著增加。而100 μg/mL的Lf就能夠提高損傷BMSCs的細胞存活率，增加細胞ALP、OCN水平，增加細胞的礦化結節(jié)，減少脂滴的生成，增加成骨分化相關基因的相對表達，減少成脂分化相關基因的相對表達。近年來也有報道證實Lf能夠促進不同來源的間充質干細胞定向成骨分化，如Ta?li等[29]發(fā)現(xiàn)Lf具有促進人源牙胚干細胞向牙源細胞分化的作用；Yagi等[30]研究發(fā)現(xiàn)Lf不僅能夠使間充質干細胞的ALP、OCN等水平提高，還可以促進軟骨分化標志物表達，而成脂分化標志物的表達受到抑制，從而證實Lf能夠誘導間充質干細胞定向成骨分化。

綜上所述，Lf能夠促進骨髓間充質干細胞增殖，使BMSCs向成骨方向進行分化，更好地促進新骨形成，也對三唑酮所誘導的骨髓間充質干細胞損傷具有修復。本研究可以為今后三唑酮殘留對BMSCs定向分化的影響提供一定的理論依據，也為Lf調控個體生長發(fā)育提供新的理論參考，對于三唑酮在體內的代謝作用機制還有待進一步研究。