張婧菲，韓紅麗，沈明明，張莉莉，王 恬*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

抗氧化物是指有能力還原、降低或者阻止氧化反應(yīng)過(guò)程的一類(lèi)化合物。在體外，測(cè)定抗氧化物的抗氧化能力有多種不同方法，包括活性自由基法和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?；钚宰杂苫ㄊ侵咐没瘜W(xué)反應(yīng)生成活性自由基，然后測(cè)定抗氧化物清除該自由基的能力。它的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)環(huán)境單一、實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重現(xiàn)性高；缺點(diǎn)是采用不同反應(yīng)原理的化學(xué)體系評(píng)價(jià)樣品的抗氧化能力，有時(shí)會(huì)得到相互矛盾的結(jié)果[1-2]。有研究者指出，制備樣品的方法不同、清除自由基原理的不同等因素都會(huì)在很大程度上影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。根據(jù)淬滅自由基的反應(yīng)原理不同，檢測(cè)方法可以分為氫過(guò)氧自由基清除能力、金屬還原能力、羥自由基（·OH）清除能力、有機(jī)自由基清除能力和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物的能力等[3]。其中，鐵離子還原/抗氧化能力（ferric-reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）、清除2,2’-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽(yáng)離子自由基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基能力是目前使用最多的評(píng)價(jià)樣品體外抗氧化能力的指標(biāo)。鑒于每個(gè)指標(biāo)檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)及其適用范圍，近年來(lái)許多研究者推薦采用兩種及以上指標(biāo)相結(jié)合的方法，更客觀、全面地評(píng)價(jià)抗氧化物的體外抗氧化能力[4]。

紅細(xì)胞的生命周期短，與其他細(xì)胞相比是一類(lèi)特異性較低的體細(xì)胞。在氧化反應(yīng)過(guò)程中，紅細(xì)胞是自由基攻擊的主要目標(biāo)[5]。一方面，紅細(xì)胞在體內(nèi)負(fù)責(zé)氧氣運(yùn)輸，因此與氧原子頻繁接觸；另一方面，紅細(xì)胞的細(xì)胞膜富含多不飽和脂肪酸，且存在于紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的血紅蛋白極易發(fā)生自氧化反應(yīng)[6]。因此，紅細(xì)胞膜是體外評(píng)價(jià)抗氧化物活性的合適介質(zhì)。在常見(jiàn)的紅細(xì)胞氧化損傷模型中，2,2’-偶氮二(2-甲基丙基咪)二鹽酸鹽（2,2’-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride，AAPH）作為一種親脂性氧化反應(yīng)誘導(dǎo)劑被廣泛使用。在水溶液中，AAPH水解生成烷基，并進(jìn)一步在氧原子的作用下轉(zhuǎn)變生成氫過(guò)氧自由基[7]。此外，AAPH也可生成·OH。這些游離的自由基可以攻擊紅細(xì)胞膜，誘導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，最終導(dǎo)致紅細(xì)胞溶血作用和細(xì)胞凋亡。

姜黃是姜科屬的一種地下莖多年生植物草本植物，主要種植于熱帶和亞熱帶地區(qū)。姜黃含有69.4%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）碳水化合物、6.3%蛋白質(zhì)、5.1%脂肪、5.8%精油和3%～6%姜黃素（curcumin，CUR）類(lèi)化合物[8]。在印度和中國(guó)等國(guó)家，姜黃被用作著色劑和香料劑，廣泛見(jiàn)于咖喱、芥末、奶酪等中[9]。此外，姜黃還是一種藥用歷史悠久的多酚類(lèi)物質(zhì)，可用于治療各種呼吸道疾?。ㄈ缦⒅夤苎缀瓦^(guò)敏）、肝功能紊亂、厭食癥、風(fēng)濕病、糖尿病、腹痛和扭傷等[10-11]。大量研究證實(shí)，姜黃提取物是一類(lèi)重要的抗氧化物。從姜黃根莖中提取的活性物質(zhì)，主要為CUR（約77%）、去甲氧基姜黃素（demethoxycurcumin，DUR）（約17%）和雙去甲氧基姜黃素（bisdemethoxycurcumin，BUR）（約3%）[12-13]。研究表明，CUR、DUR和BUR的化學(xué)結(jié)構(gòu)十分相近，是姜黃屬藥用植物的最主要活性成分。它們的藥理作用廣泛，耐受性好、毒性低，因此在醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。許多學(xué)者將這3 種化合物統(tǒng)稱(chēng)為總CUR。

CUR是近幾年食品科學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。相對(duì)而言，關(guān)于DUR和BUR的研究相對(duì)滯后。與CUR一樣，DUR、BUR可保護(hù)DNA免受氧化損傷[14]。近來(lái)研究表明，雖然3 種CUR的藥理學(xué)活性相似，但其抗氧化活性仍存在較大差異。在脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)體系中，DUR、BUR的抗氧化活性較CUR相比更強(qiáng)；但在自由基體系中，CUR的抗氧化活性最強(qiáng)，其次才是DUR和BUR[15-16]。在體外細(xì)胞模型中，Zhang Lijia等利用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）建立體外細(xì)胞損傷模型，研究發(fā)現(xiàn)CUR與BUR發(fā)揮了相似的細(xì)胞保護(hù)作用；但較CUR相比，BUR對(duì)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷更加敏感[17]。上述結(jié)果提示，3 種CUR在動(dòng)物體內(nèi)的抗氧化活性很可能存在差異。

本團(tuán)隊(duì)前期通過(guò)體外化學(xué)法和紅細(xì)胞氧化損傷模型，測(cè)定了CUR的體外抗氧化能力，并且比較了CUR和其他幾種天然色素的抗氧化活性差異。但目前關(guān)于3 種CUR在體外的抗氧化能力差異，尚缺乏系統(tǒng)的研究?；诖?，本實(shí)驗(yàn)以CUR、DUR和BUR為對(duì)象，同時(shí)選取二丁基羥基甲苯（butylated hydroxytoluene，BHT）和丁羥茴醚（butylated hydroxyanisole，BHA）為對(duì)照物，測(cè)定自由基清除率和金屬離子還原力，研究其對(duì)AAPH處理的雞紅細(xì)胞溶血率、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性的影響。以期為進(jìn)一步研究CUR及其類(lèi)似物的抗氧化活性差異提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

ABTS、DPPH、AAPH 西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；CUR、DUR、BUR（純度大于98%[11]）廣州科虎生物技術(shù)研發(fā)中心；BHT、BHA等其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA224S-CW電子分析天平 德國(guó)賽多利斯公司；Multiskan GO多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；5804/5804R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)德國(guó)Eppendorf公司；DK-S24電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Vortex-Genie 2漩渦混合器美國(guó)Scientific Industries公司；S-250D超聲波破碎儀美國(guó)Branson公司。

1.3 方法

1.3.1 ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力的測(cè)定

參考do Carmo Brito等[14]的方法，以ABTS水溶液（7 mmol/L）為溶劑，配制過(guò)硫酸鉀溶液（2.45 mmol/L），于室溫下避光穩(wěn)定12～16 h。以乙醇作為稀釋介質(zhì)，選取合適的稀釋比例，調(diào)整過(guò)硫酸鉀溶液于734 nm波長(zhǎng)處的吸光度為0.700±0.025。取0.195 mL上述溶液與0.65 mL樣品溶液（濃度分別為0、2、4、,6、8、10、20 μmol/L）充分混合，于30 ℃條件下反應(yīng)30 min。用蒸餾水調(diào)零，于734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，結(jié)果記為A樣品。用0.65 mL的乙醇溶液代替樣品溶液作為對(duì)照管，進(jìn)行相同的處理后，于734 nm波長(zhǎng)處其吸光度，結(jié)果記為A對(duì)照。每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次，取平均值。按式（1）計(jì)算樣品的ABTS陽(yáng)離子自由基清除率。選取Trolox為參照物，配制不同濃度的Trolox溶液，代替樣品溶液進(jìn)行上述反應(yīng)，利用相對(duì)應(yīng)的吸光度繪制Trolox清除率的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算樣品相對(duì)應(yīng)于Trolox的清除率。樣品的ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力以Trolox計(jì)，單位為μmol/L。

1.3.2 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

參考Oliveira等[18]的方法，配制DPPH自由基乙醇溶液（0.1 mmol/L），而后裝入棕色瓶子中置于陰涼處，現(xiàn)配現(xiàn)用。取0.65 mL樣品溶液與0.195 mL DPPH自由基乙醇溶液（0.1 mmol/L）充分混合，于室溫下避光反應(yīng)30 min。用乙醇溶液調(diào)零，于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，結(jié)果記為A樣品。用0.65 mL的乙醇溶液代替樣品溶液作為對(duì)照管，進(jìn)行相同的處理后，于517 nm波長(zhǎng)處其吸光度，結(jié)果記為A對(duì)照。每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次，取平均值。按式（1）計(jì)算樣品的DPPH自由基清除率。后續(xù)操作同1.3.1節(jié)，樣品的DPPH自由基清除能力以Trolox計(jì)，單位為μmol/L。

1.3.3 ·OH清除率的測(cè)定

參考Ohata等[19]的方法，取0.1 mL樣品溶液與0.15 mL 2-脫氧核糖（5 mmol/L）、0.4 mL磷酸鈉緩沖液（0.75 mol/L，pH 7.4）、0.25 mL雙蒸水和0.1 mL硫酸亞鐵溶液（7.5 mmol/L）混合。向上述混合液中加入0.1 mL過(guò)氧化氫溶液（體積分?jǐn)?shù)1%），并充分混勻。37 ℃水浴條件下反應(yīng)1 h后，于536 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，結(jié)果記為A樣品。用相同體積的雙蒸水代替樣品溶液作為對(duì)照管，進(jìn)行相同的處理后，于536 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，結(jié)果記為A對(duì)照。每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次，取平均值。按式（1）計(jì)算樣品的·OH清除率。后續(xù)操作同1.3.1節(jié)，樣品的·OH清除能力以Trolox計(jì)，單位為μmol/L。

1.3.4 O2-·清除能力的測(cè)定

參考Lim等[20]的方法，以磷酸鈉緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.4）為溶劑，分別配制氯化硝基四氮唑藍(lán)溶液（150 μmol/L）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸溶液（468 μmol/L）和吩嗪硫酸甲酯溶液（60 μmol/L）。取1 mL樣品溶液與1 mL氯化硝基四氮唑藍(lán)溶液、1 mL煙酰胺腺嘌呤二核苷酸溶液混合，加入1 mL吩嗪硫酸甲酯溶液后立即充分混勻。室溫條件下反應(yīng)5 min后，于560 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，結(jié)果記為A樣品。用1 mL的磷酸鈉緩沖液代替樣品作為對(duì)照管，進(jìn)行相同的處理后，于560 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，結(jié)果記為A對(duì)照。每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次，取平均值。按式（1）計(jì)算樣品超氧陰離子自由基（O2-·）清除率。后續(xù)操作同1.3.1節(jié)，樣品的O2-·清除能力以Trolox計(jì)，單位為μmol/L。

1.3.5 FRAP的測(cè)定

FRAP的測(cè)定參考Tang Yao等[21]的方法。具體步驟如下：以鹽酸溶液（40 mmol/L）為溶劑，配制2,4,6-三吡啶基三嗪溶液（10 mmol/L）。醋酸鹽緩沖液（0.3 mol/L、pH 3.6）、2,4,6-三吡啶基三嗪溶液溶液（10 mmol/L）和氯化鐵溶液（20 mmol/L）按體積比10∶1∶1充分混合，于37 ℃條件下進(jìn)行預(yù)熱。取300 μL預(yù)熱的FRAP試劑，加入30 μL的超純水和10 μL的樣品溶液，充分混合后于37 ℃水浴條件下避光反應(yīng)30 min。于593 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以七水硫酸亞鐵代替樣品溶液進(jìn)行上述反應(yīng)，利用相對(duì)應(yīng)的吸光度繪制七水硫酸亞鐵還原力的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算樣品相對(duì)應(yīng)于七水硫酸亞鐵的FRAP。每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次，取平均值。

1.3.6 抑制脂質(zhì)過(guò)氧化能力的測(cè)定

抑制脂質(zhì)過(guò)氧化能力的測(cè)定參考Awah等[22]的硫代巴比妥酸法。具體步驟如下：以磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）為勻漿介質(zhì)，配制新鮮的蛋黃勻漿液500 μL（體積分?jǐn)?shù)10%）。以3 g硫代巴比妥酸、120 g三氯乙酸、10.4 mL高氯酸（體積分?jǐn)?shù)70%）和800 mL蒸餾水配制硫代巴比妥酸反應(yīng)液。取100 μL樣品溶液以蒸餾水稀釋至1.0 mL，然后加入50 μL硫酸亞鐵溶液（0.075 mol/L）、20 μL VC（0.1 mol/L）。充分混合后，在37 ℃下反應(yīng)1 h。冷卻后加入200 μL的乙二胺四乙酸溶液（0.1 mol/L）和1.5 mL上述的硫代巴比妥酸反應(yīng)液，在100 ℃沸水浴下反應(yīng)15 min。冷卻后3 000 r/min離心10 min。上清液于532 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。按式（2）計(jì)算樣品的脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率。

1.3.7 AAPH誘導(dǎo)雞紅細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)

采取新鮮雞血，用肝素抗凝，1 500×g離心10 min，棄上清液，所得沉淀為雞紅細(xì)胞。加入合適體積的緩沖液（4 ℃預(yù)冷，pH 7.4，含150 mmol/L氯化鈉、1.9 mmol/L磷酸二氫鈉、8.1 mmol/L磷酸氫二鈉），輕柔吹散雞紅細(xì)胞，形成均勻的雞紅細(xì)胞懸浮液，然后于1 500×g離心10 min，棄上清液。如此反復(fù)，用緩沖液清洗雞紅細(xì)胞3 次。最后，加入適量的緩沖液，制備成質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的雞紅細(xì)胞懸浮液備用。

AAPH通過(guò)生成水溶性的脂質(zhì)過(guò)氧化自由基，可誘導(dǎo)雞紅細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷[23]。將分離得到的新鮮紅細(xì)胞懸浮液分為不同的處理組，即未處理的紅細(xì)胞懸浮液（對(duì)照，CON）、AAPH處理過(guò)的紅細(xì)胞懸浮液、AAPH處理過(guò)的紅細(xì)胞懸浮液＋不同濃度的3 種不同濃度CUR：取質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%雞紅細(xì)胞懸浮液，分別加入不同濃度的CUR溶液（終濃度為0.5、1、5、10、20 μmol/L），于37 ℃條件下孵育30 min。然后加入AAPH溶液（75 mmol/L），充分混勻后恒溫孵育5 h。

1.3.7.1 紅細(xì)胞溶血率的測(cè)定

紅細(xì)胞溶血率的測(cè)定參考Magalhaes等[24]的方法。具體步驟如下：每隔1 h取出等體積的雞紅細(xì)胞懸浮液，1 500×g離心10 min，棄上清液。按體積比1∶7向紅細(xì)胞沉淀中加入150 mmol/L的生理鹽水，充分混勻后1 500×g離心10 min。取上清液于540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，所得結(jié)果記為A。以雙蒸水代替生理鹽水，誘導(dǎo)雞紅細(xì)胞完全溶血，離心后取上清液于540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，所得結(jié)果記為A’。每個(gè)濃度樣品溶液平行測(cè)定3 次，計(jì)算平均值。雞紅細(xì)胞溶血率按式（3）計(jì)算。

1.3.7.2 紅細(xì)胞SOD活力和MDA含量的測(cè)定

超聲波破碎法破碎雞紅細(xì)胞樣品，采用試劑盒測(cè)定SOD活力和MDA含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2013軟件初步整理后，先用SPSS 17.0軟件進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)。然后，采用SPSS 17.0軟件的單因素方差分析，利用Tukey法進(jìn)行組間顯著性比較。所有結(jié)果均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 3 種CUR對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基、DPPH自由基、·OH和O2-·清除率的影響

圖1 3 種CUR對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基（A）、DPPH自由基（B）、·OH（C）和O－2·（D）清除率Fig. 1 Scavenging effects of curcuminoids on ABTS radical cation (A),DPPH radical (B), ·OH (C) and O2-· (D)

由圖1A可知，3 種CUR對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除率呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性。在1～20 μmol/L濃度范圍內(nèi)，隨著樣品濃度的升高，其對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除率也逐漸升高。在濃度為20 μmol/L時(shí)，不同樣品對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基清除率由高到低為BHA＞BUR＞CUR＞BHT＞DUR。與BHT相比，CUR和BUR對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除率均有顯著提高（P＜0.05）。與DUR相比，CUR和BUR對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除率分別顯著提高了49.62%和77.36%（P＜0.05）。

由圖1B可知，DUR和BUR對(duì)DPPH自由基的清除率呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性，在1～20 μmol/L濃度范圍內(nèi)，隨著樣品濃度的升高，其對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除率逐漸升高。CUR對(duì)DPPH自由基的清除率在1～10 μmol/L范圍內(nèi)隨濃度升高而升高，且在10 μmol/L時(shí)達(dá)到最大值。在濃度為20 μmol/L時(shí)，不同樣品對(duì)DPPH自由基清除率由高到低為DUR＞BHT＞BUR＞CUR＞BHA。與BHT相比，DUR對(duì)DPPH自由基的清除率顯著提高（P＜0.05），BUR差異不顯著（P＞0.05），CUR則顯著降低（P＜0.05）。BUR和CUR兩者對(duì)DPPH自由基的清除率無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

由圖1C可知，3 種CUR對(duì)·OH的清除率呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性。在10～400 μmol/L范圍內(nèi)，隨著濃度的升高，其對(duì)·OH的清除率也逐漸升高。在濃度為400 μmol/L時(shí)，不同樣品對(duì)·OH清除率由高到低為BHT＞BHA＞BUR＞DUR＞CUR。與BHA和BHT相比，3 種CUR對(duì)·OH的清除率均有顯著降低（P＜0.05）。與CUR相比，DUR和BUR對(duì)·OH的清除率分別顯著提高了20.00%和28.78%（P＜0.05）。DUR和BUR兩者對(duì)·OH的清除率無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

由圖1D可知，3 種CUR對(duì)O2-·的清除率呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性。在10～400 μmol/L范圍內(nèi)，隨著濃度的升高，其對(duì)O2-·的清除率也逐漸升高。在濃度為400 μmol/L時(shí)，不同樣品對(duì)·OH清除率由高到低為BUR＞CUR＞BHA＞BHT＞DUR。與DUR相比，BUR和CUR對(duì)O2-·的清除率分別顯著提高了59.76%和36.41%（P＜0.05）。

2.2 3 種CUR對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基、DPPH自由基、·OH、O2-·的半抑制濃度

表1 3 種CUR對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基、DPPH自由基、·OH、·的IC50（n＝8）Table 1 IC50 for scavenging effects of curcuminoids on ABTS radical cation, DPPH radical, ·OH and O－2· (n= 8)

表1 3 種CUR對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基、DPPH自由基、·OH、·的IC50（n＝8）Table 1 IC50 for scavenging effects of curcuminoids on ABTS radical cation, DPPH radical, ·OH and O－2· (n= 8)

組別 IC50/（μmol/L）ABTS陽(yáng)離子自由基 DPPH自由基 ·OH O2-·CUR 16.28 4.89 81.01 135.40 DUR 27.66 5.18 77.41 209.03 BUR 14.91 18.49 77.95 124.67 BHT 26.03 35.05 38.87 182.19 BHA 14.09 59.55 47.26 182.72

表1為3 種CUR對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基、DPPH自由基、·OH、O2-·的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。就ABTS陽(yáng)離子自由基和O2-·而言，3 種CUR中，BUR的IC50最低，然后依次是CUR和DUR。就DPPH自由基而言，CUR的IC50值最低，BUR的IC50最高。就·OH而言，3 種CUR中，DUR和BUR的IC50相近，CUR的IC50最高。

2.3 3 種CUR對(duì)FRAP的影響

圖2 3 種CUR對(duì)FRAP的影響Fig. 2 Ferric reducing antioxidant power of curcuminoids

由圖2可知，3 種CUR的FRAP結(jié)果呈現(xiàn)明顯的濃度依賴(lài)性。在1～400 μmol/L濃度范圍內(nèi)，隨著樣品濃度的升高，其FRAP也逐漸升高。在濃度為400 μmol/L時(shí)，BHA的FRAP最大，CUR次之；其中，3 種CUR處理組間的FRAP均差異顯著（P＜0.05）。400 μmol/L時(shí)不同樣品的FRAP由高到低為：BHA＞CUR＞DUR＞BUR＞BHT。

2.4 3 種CUR對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)抑制率的影響

圖3 3 種CUR對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)抑制率的影響Fig. 3 Inhibitory activity of curcuminoids on lipid peroxidation

由圖3可知，3 種CUR均可有效抑制蛋黃卵磷脂的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，且這種抑制作用呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性。在1～400 μmol/L濃度范圍內(nèi)，隨著樣品濃度的升高，它們對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的抑制率也逐漸升高。在濃度為400 μmol/L時(shí)，BUR的抑制率最高。不同樣品對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的抑制率由高到低為BUR＞DUR＞CUR＞BHT＞BHA。與CUR相比，BUR和DUR對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的抑制率分別顯著提高了34.15%和54.16%（P＜0.05）。

2.5 3 種CUR對(duì)AAPH誘導(dǎo)的紅細(xì)胞溶血率的影響

圖4 3 種CUR對(duì)AAPH誘導(dǎo)的紅細(xì)胞溶血率的影響Fig. 4 Effects of curcuminoids on AAPH-induced erythrocyte hemolysis

由圖4可知，經(jīng)AAPH處理后，紅細(xì)胞的溶血率較對(duì)照組相比顯著提高（P＜0.05）。在0.5～20 μmol/L時(shí)，孵育1 h后，與AAPH組相比，3 種CUR均顯著降低了紅細(xì)胞的溶血率（P＜0.05）；并且這種抑制作用呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性。但3 種CUR處理組間的溶血率差異不顯著（P＞0.05）。孵育3 h后，在0.5 μmol/L時(shí)，與AAPH組相比，DUR和BUR顯著降低了紅細(xì)胞的溶血率（P＜0.05）。在1～20 μmol/L時(shí)，紅細(xì)胞分別經(jīng)3 種CUR處理后溶血率較AAPH組相比顯著降低（P＜0.05）。在20 μmol/L時(shí)，與CUR組相比，DUR和BUR組的紅細(xì)胞溶血率顯著降低（P＜0.05）。在0.5～20 μmol/L時(shí)，孵育5 h后，與AAPH組相比，3 種CUR均顯著降低了紅細(xì)胞的溶血率（P＜0.05）。在20 μmol/L時(shí)，與CUR組相比，DUR和BUR組的紅細(xì)胞溶血率更低（P＜0.05）。

2.6 3 種CUR對(duì)AAPH誘導(dǎo)的紅細(xì)胞MDA含量的影響

由圖5可知，在0.5～20 μmol/L時(shí)，孵育1 h后，3 種CUR處理可明顯抑制AAPH誘導(dǎo)的紅細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，降低MDA含量（P＜0.05）。在0.5～20 μmol/L時(shí)，孵育3 h后，與AAPH組相比，3 種CUR均顯著降低了紅細(xì)胞的MDA含量（P＜0.05）；并且這種抑制作用呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性。在10 μmol/L時(shí)，3 種CUR處理組間的紅細(xì)胞MDA含量差異顯著（P＜0.05）。孵育5 h后， 3 種CUR在不同濃度時(shí)均可有效抑制AAPH誘導(dǎo)的紅細(xì)胞MDA含量升高（P＜0.05）。其中，在1～10 μmol/L時(shí)，與CUR組相比，DUR和BUR顯著降低了紅細(xì)胞的MDA含量（P＜0.05）。在20 μmol/L時(shí)，經(jīng)BUR處理后的紅細(xì)胞MDA含量更低；且與CUR和DUR處理組相比差異顯著（P＜0.05）。

圖5 3 種CUR對(duì)AAPH誘導(dǎo)的紅細(xì)胞MDA含量的影響Fig. 5 Effects of curcuminoids on MDA content in erythrocytes induced by AAPH

2.7 3 種CUR對(duì)AAPH誘導(dǎo)的紅細(xì)胞SOD活力的影響

由圖6可知，在37 ℃條件下孵育5 h后，CON組的紅細(xì)胞SOD活力沒(méi)有隨著時(shí)間的變化產(chǎn)生顯著差異（P＞0.05）。經(jīng)AAPH處理后，紅細(xì)胞的SOD活性較對(duì)照組相比顯著降低（P＜0.05）。在0.5～20 μmol/L時(shí)，孵育1 h后，與AAPH組相比，3 種CUR均顯著提高了紅細(xì)胞的SOD活力（P＜0.05）。在0.5 μmol/L時(shí)，孵育3 h后，與AAPH組相比，CUR和DUR顯著提高了紅細(xì)胞的SOD活力（P＜0.05）。在1～20 μmol/L時(shí)，經(jīng)3 種CUR處理后的紅細(xì)胞SOD活性較AAPH組相比顯著提高（P＜0.05）。在20 μmol/L時(shí)，與CUR組相比，DUR和BUR組的紅細(xì)胞SOD活力更高（P＜0.05）。孵育5 h后，3 種CUR在不同濃度下均可有效抑制AAPH誘導(dǎo)的紅細(xì)胞SOD活力降低（P＜0.05）。其中，在1 μmol/L時(shí)，與DUR組相比，CUR和BUR顯著提高了紅細(xì)胞的SOD活力（P＜0.05）。在5～10 μmol/L時(shí)，經(jīng)DUR和BUR處理后的紅細(xì)胞SOD活力較CUR處理組相比顯著提高（P＜0.05）。在20 μmol/L時(shí)，CUR和DUR組的紅細(xì)胞SOD活力更高，且較BUR組差異顯著（P＜0.05）。

圖6 3 種CUR對(duì)AAPH誘導(dǎo)的紅細(xì)胞SOD活力的影響Fig. 6 Effects of curcuminoids on SOD activity in erythrocytes induced by AAPH

3 討 論

ABTS陽(yáng)離子自由基和DPPH自由基清除率是兩種廣泛使用的體外抗氧化力檢測(cè)指標(biāo)。它們的反應(yīng)原理相同，都是基于樣品提供H原子或質(zhì)子來(lái)淬滅自由基，并通過(guò)反應(yīng)液的顏色變化來(lái)評(píng)估自由基清除率的高低[25]。Zhang Jingfei等[26]測(cè)定了CUR對(duì)DPPH自由基的清除率，提示CUR對(duì)DPPH自由基有良好的清除率，且在一定濃度范圍內(nèi)，CUR對(duì)DPPH自由基的清除率存在明顯的濃度依賴(lài)性。本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步比較了3 種CUR對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基和DPPH自由基清除率。結(jié)果顯示，DUR和BUR與CUR類(lèi)似，可以有效地中和DPPH自由基，并且在1～20 μmol/L濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)一定的濃度依賴(lài)性。這與Kim等[27]的研究結(jié)果一致。就ABTS陽(yáng)離子自由基清除率而言，BUR的清除率與人工合成抗氧化劑BHA相近，并在20 μmol/L濃度時(shí)顯著高于CUR和BUR。

·OH能與絕大部分生物大分子物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，包括細(xì)胞中的碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA。·OH散逸可導(dǎo)致細(xì)胞損傷和大面積的細(xì)胞凋亡[28]。因此，及時(shí)清除多余的·OH對(duì)保護(hù)機(jī)體的正常生命活動(dòng)和生理代謝反應(yīng)具有重要作用。O2-·是線(xiàn)粒體呼吸鏈反應(yīng)的一種自由基副產(chǎn)物。生成的O2-·可以進(jìn)一步反應(yīng)產(chǎn)生另一種活性氧自由基H2O2。H2O2在過(guò)氧化氫或谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的催化下最終將自由基轉(zhuǎn)化為水[29]。因此，有效清除O2-·是發(fā)揮線(xiàn)粒體抗氧化防御功能的重要環(huán)節(jié)之一。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3 種CUR都能有效地清除·OH和O2-·。3 種CUR相互比較而言，BUR的清除活性最高。目前關(guān)于這3 種CUR對(duì)不同自由基清除率的比較研究很少，尤其對(duì)造成它們抗氧化活性差異的原因仍無(wú)法給出統(tǒng)一的解釋。推測(cè)這種差異一方面是因?yàn)椴煌淖杂苫磻?yīng)基于不同的中和原理；另一方面可能與3 種CUR的功能基團(tuán)不同有關(guān)[30]。

生物脂質(zhì)對(duì)氧化反應(yīng)非常敏感，不僅因?yàn)樗缓伙柡椭舅?，而且它與機(jī)體內(nèi)的酶促和非酶系統(tǒng)之間存在密切聯(lián)系。脂質(zhì)過(guò)氧化是一個(gè)典型的自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，通過(guò)從不飽和脂肪酸側(cè)鏈上吸收一個(gè)H原子繼而引發(fā)一系列的自由基聚合反應(yīng)，這也是導(dǎo)致細(xì)胞膜破損和細(xì)胞壞死的一個(gè)重要機(jī)制之一[28]。因此，不同樣品對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的抑制率是體外檢測(cè)樣品抗氧化活性的一個(gè)重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)選取蛋黃卵磷脂作為脂質(zhì)底物，比較研究3 種CUR對(duì)蛋黃脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)抑制率的影響。結(jié)果顯示，3 種CUR都能有效地抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。其中，BUR和DUR的抑制率顯著高于CUR。這一結(jié)果與Jayaprakasha等[31]的研究結(jié)果一致。

紅細(xì)胞膜富含不飽和脂肪酸，在氧化反應(yīng)過(guò)程中是自由基攻擊的主要目標(biāo)。游離的自由基會(huì)誘導(dǎo)磷脂重排反應(yīng)，并將磷脂酰絲氨酸暴露在細(xì)胞膜外側(cè)的小葉上，最終導(dǎo)致過(guò)氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的發(fā)生[32]。與成熟的哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞不同，家禽的紅細(xì)胞有完整的細(xì)胞核、線(xiàn)粒體、溶酶體和高爾基體等細(xì)胞器。一旦發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，可激活若干生物機(jī)制參與對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用，緩解自由基誘導(dǎo)的紅細(xì)胞溶血作用和血紅蛋白的氧化。因此，家禽紅細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能上的特異性使其成為一種易于操作的細(xì)胞模型，尤其適合用于與氧化應(yīng)激相關(guān)的研究。本實(shí)驗(yàn)利用水溶性自由基AAPH誘導(dǎo)雞紅細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，然后通過(guò)測(cè)定紅細(xì)胞的溶血率、MDA含量和SOD活力，比較3 種CUR的抗氧化潛力。結(jié)果顯示，3 種CUR均能發(fā)揮良好的抗氧化活性，并在一定程度上緩解紅細(xì)胞的氧化損傷。多酚類(lèi)物質(zhì)的抗氧化機(jī)制之一是通過(guò)降低脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)和自由基活性來(lái)穩(wěn)定細(xì)胞膜[33]。有研究指出，酚類(lèi)化合物的疏水性使其主要富集在細(xì)胞膜和脂蛋白等脂質(zhì)含量豐富的區(qū)域[34]。3 種CUR屬于天然提取的一類(lèi)多酚化合物，可以通過(guò)整合到細(xì)胞雙層膜的疏水核心區(qū)，降低細(xì)胞膜的流動(dòng)性和穩(wěn)定性，限制自由基的擴(kuò)散，提高抗氧化效率。本實(shí)驗(yàn)中MDA的研究結(jié)果也在一定程度上證實(shí)了上述CUR類(lèi)化合物的可能抗氧化作用機(jī)制。

值得注意的是，綜合本實(shí)驗(yàn)中紅細(xì)胞的3 個(gè)測(cè)定指標(biāo)結(jié)果，認(rèn)為DUR和BUR對(duì)紅細(xì)胞的保護(hù)作用優(yōu)于CUR。Toda等[35]也以紅細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，研究? 種CUR對(duì)·OH誘導(dǎo)的大鼠紅細(xì)胞溶血率和脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的影響，但其研究發(fā)現(xiàn)，與DUR和BUR相比，CUR對(duì)紅細(xì)胞的保護(hù)作用更顯著。這一發(fā)現(xiàn)與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果不一致。而Sheejayan等[36]以大鼠腦和肝組織勻漿液為介質(zhì)，研究3 種CUR對(duì)鐵離子催化下脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的影響，也得到了與上述研究不同的結(jié)果，其認(rèn)為3 種CUR的抗氧化活性基本一致。由于目前關(guān)于CUR、DUR和BUR的抗氧化活性差異的報(bào)道比較少，可供參考和比較的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不多。因此，推測(cè)反應(yīng)體系、誘導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的自由基種類(lèi)和發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)的脂質(zhì)種類(lèi)都可能會(huì)影響CUR類(lèi)化合物的抗氧化活性發(fā)揮，并導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的參差不齊。

抗氧化劑的抗氧化能力與其化學(xué)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，尤其是它的功能基團(tuán)。根據(jù)功能基團(tuán)不同，常見(jiàn)的抗氧化化合物可以分為兩類(lèi)：酚醛類(lèi)和β-二酮基類(lèi)。自然界中絕大部分的天然抗氧化劑含有酚基或β-二酮基。CUR的化學(xué)結(jié)構(gòu)很特別，是一個(gè)高度對(duì)稱(chēng)的分子，既有β-二酮基又有酚羥基。它的主要功能基團(tuán)包括：β-二酮基、兩個(gè)酚羥基、甲氧基、羰基[37-38]。羰基是CUR的主要顯色基團(tuán)，目前鮮有研究發(fā)現(xiàn)羰基與CUR抗氧化活性的相關(guān)。近年來(lái)的主流研究認(rèn)為，β-二酮基和酚羥基是影響CUR抗氧化活性的主要功能基團(tuán)。目前關(guān)于甲氧基在抗氧化活性中發(fā)揮的作用研究很少[39-40]。但有研究顯示，若酚羥基的鄰位存在甲氧基，可以提高酚羥基的抗氧化活性[30]。從化學(xué)結(jié)構(gòu)上看，3 種CUR的唯一不同是甲氧基數(shù)量。CUR在動(dòng)物體內(nèi)不穩(wěn)定，大部分會(huì)被迅速降解為阿魏酸和阿魏酰甲烷。阿魏酸也是一種潛在的生物活性物質(zhì)，具有多種藥理學(xué)功能，例如抗氧化活性。有研究報(bào)道，阿魏酸的抗氧化活性甚至優(yōu)于CUR[41-42]。馮生光[43]研究了CUR和DUR的降解途徑，推測(cè)它們?cè)诒芤汉托∈篌w內(nèi)的可能降解產(chǎn)物存在明顯不同，其中就包括阿魏酸和反式阿魏酸。然而，目前尚缺乏去DUR和BUR在機(jī)體內(nèi)的分解代謝途徑的相關(guān)研究。因此推測(cè)，CUR及其代謝產(chǎn)物的存在可部分解釋其與DUR、BUR在某些自由基體系中的抗氧化活性差異。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與CUR類(lèi)似，DUR和BUR均表現(xiàn)出良好的抗氧化活性。3 種CUR能有效地中和ABTS陽(yáng)離子自由基、DPPH自由基、·OH和O2-·，具有較高的FRAP和脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率。在紅細(xì)胞模型中，3 種CUR顯著降低了AAPH誘導(dǎo)的紅細(xì)胞溶血率和抑制了MDA含量升高，并提高了SOD活力。同時(shí)，3 種CUR的抗氧化活性還存在差異。就ABTS陽(yáng)離子自由基、·OH和O2-·清除率和脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率而言，BUR的活性最佳。在緩解紅細(xì)胞氧化損傷方面，DUR和BUR的抗氧化力較CUR相比更顯著。