王 玉

(淮安市食品藥品檢驗所，江蘇 淮安 223300)

止咳丸是傳統(tǒng)中成藥品種，創(chuàng)制于清光緒33年，是由麻黃、陳皮、枳殼、紫蘇子、甘草、黃芩(酒炙)等二十幾種中藥材加工制成的復(fù)方純中藥制劑[1]。該制劑收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑第十一冊》，具降氣化痰，止咳定喘之功效，可用于風寒入肺、肺氣不宣引起的咳嗽痰多，喘促胸悶，周身酸痛或久咳不止，以及老年急慢性支氣管炎，療效卓著[2]。但現(xiàn)行質(zhì)量標準只有顯微鑒別和理化鑒別，局限性大，難以準確控制制劑質(zhì)量，因此需要建立一種簡便、準確的定量分析方法來控制其內(nèi)在含量。本實驗分析該方方劑組成，選擇柚皮苷、橙皮苷及新橙皮苷作為本品的質(zhì)控指標，為該制劑的質(zhì)量控制和標準提高提供科學依據(jù)[3]。

1 儀器、藥品與試劑

1.1 儀 器

UltiMate 3000高效液相色譜儀，DIONEX公司；XP-6電子天平，梅特勒電子有限公司；XS205-DU電子天平，梅特勒電子有限公司；KH72000數(shù)控超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；HWS26電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學儀器有限公司。

1.2 藥品與試劑

止咳丸(生產(chǎn)單位：昆明中藥廠有限公司；批準文號：國藥準字Z53021162；生產(chǎn)批號：281477、291859、291659)；柚皮苷對照品(純度91.7%，批號：110722-201815)、橙皮苷對照品(純度96.2%，批號：110721-201818)、新橙皮苷對照品(純度99.2%，批號：111857-201703)，均購自中國食品藥品研究院。

甲醇為色譜純，水為純化水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：甲醇-0.2%冰醋酸溶液(31∶69)；檢測波長：283 nm；柱溫：35 ℃；流速：1.0 mL/min；進樣量：5 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液

分別精密稱取柚皮苷6.335 mg、橙皮苷3.170 mg、新橙皮苷2.911 mg置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻作為對照貯備溶液。

2.2.2 供試品溶液

取本品(生產(chǎn)批號：281477)適量，除去糖衣，研細，精密稱取1 g，置具塞具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，用0.45 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液

制備缺陳皮和枳殼的陰性對照樣品，精密稱取1 g，按“2.2.2”方法制備陰性對照溶液。

2.3 專屬性實驗

圖1 對照品、供試品及陰性對照HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of standard sample, Zhike Wan sample and negative sample

取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各5 μL，照“2.1”項下方法測定。結(jié)果顯示，目標成分分離效果好，且陰性對照溶液在目標成分相同保留時間處未檢出色譜峰。表明該方法專屬性強。

2.4 線性范圍考察

精密吸取對照貯備液0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、3.0 mL、5.0 mL、10 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取5 μL注入色譜儀，記錄色譜圖，以濃度(mg/mL)為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。柚皮苷的回歸方程：y=5.1331x(r=0.9996)；橙皮苷的回歸方程：y=5.0754x(r=0.9999)；新橙皮苷的回歸方程：y=54.9323x(r=0.9996)。

結(jié)果表明，柚皮苷在11.62～232.36 μg/mL、橙皮苷在6.10～121.98 μg/mL、新橙皮苷在5.78～115.5 μg/mL的范圍內(nèi)與面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度實驗

精密吸取對照品溶液5 μL，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，柚皮苷峰面積的相對標準偏差(RSD)為1.15%，橙皮苷峰面積的RSD為0.78%，新橙皮苷峰面積的RSD為0.86%。

2.6 穩(wěn)定性實驗

取“2.2.2”項下供試品溶液，在0、1、2、4、8、12、24、48 h分別進樣5 μL，注入色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，柚皮苷、橙皮苷及新橙皮苷峰面積RSD分別為0.76%、0.88%、1.03%，說明該供試品溶液在48 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性實驗

精密稱取同一批號(生產(chǎn)批號：281477)供試品6份1.0007 g、1.0008 g、1.0041 g、1.0039 g、1.0038 g、1.0094 g，按“2.2.2”項下供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液，照“2.1”項下方法測定。結(jié)果表明，柚皮苷平均含量為1.95 mg/g，RSD為0.78%；橙皮苷平均含量為3.78 mg/g，RSD為0.46%；新橙皮苷平均含量為1.13 mg/g，RSD為0.83%。

2.8 加樣回收率實驗

精密稱取已知含量的同一批(生產(chǎn)批號：281477；含量：柚皮苷含量為1.95 mg/g、橙皮苷含量為3.78 mg/g、新橙皮苷含量為1.13 mg/g)供試品6份，每份約0.5 g，分別精密加入一定量的3種成分對照品，按“2.2.2”項下方法制備樣品溶液，照“2.1”項下色譜條件分別測定柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含量，計算回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率結(jié)果(n=6)Table 1 Results of recovery rate tests(n=6)

續(xù)表1

2.9 樣品測定

取3批次止咳丸，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，照“2.1”項下方法測定，計算含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品測定結(jié)果Table 2 Results of content determination of samples

3 討 論

3.1 提取條件的選擇

實驗過程中對提取溶劑(70%乙醇、甲醇、50%甲醇)、提取方法(超聲30 min、回流30 min)、提取時間(回流30 min、回流1 h、回流1.5 h)、提取溶劑用量(25 mL、50 mL、100 mL)進行了考察[4-6]，結(jié)果表明以50 mL甲醇為溶劑，回流30 min的提取效果最好。

3.2 色譜條件的選擇

本實驗考察了乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.2%冰醋酸作為流動相[7]。結(jié)果顯示甲醇-0.2%冰醋酸(31∶69)分離度、對稱因子最佳；另在實驗過程發(fā)現(xiàn)，進樣量為20 μL或10 μL時峰形均較差，對稱因子過小，不符合要求，故設(shè)定進樣量為5 μL。

此外，本研究從柱溫(30 ℃、35 ℃、40 ℃)、流速(0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min)和不同品牌色譜柱{Symmetry C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)}三方面考察了該法的耐用性。結(jié)果顯示：柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷峰均能實現(xiàn)良好分離。說明該法可靠。

3.3 結(jié) 論

止咳中成藥在中成藥中占有相當大的比例，而化學成分是治療疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)，但止咳丸現(xiàn)行質(zhì)量標準無任何含量測定項目，這具有很大的局限性。方中的陳皮、枳殼是常用止咳藥配方，而黃酮類成分為其主要活性成分[8-10]。本研究建立HPLC法，同時測定柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷三種成分，體現(xiàn)了一法多測的分析理念，能有效控制該產(chǎn)品的質(zhì)量，也為止咳丸標準提高提供基礎(chǔ)支撐。