戴 域，李守權(quán)，羅 浩

(貴州省地質(zhì)礦產(chǎn)中心實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550018)

土壤堿解氮常作為土壤氮素有效性的指標(biāo)，能夠確切反映近期內(nèi)土壤的供氮水平[1]。精確衡量土壤的供氮能力，進(jìn)行有效施肥，不但確保了農(nóng)業(yè)的增產(chǎn)增收，對(duì)我國(guó)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展和控制土壤污染具有重要而深遠(yuǎn)的意義。

目前，土壤堿解氮一般通過(guò)堿解擴(kuò)散法測(cè)定，此法所采用的擴(kuò)散皿在測(cè)定過(guò)程中極易引起交叉污染，易導(dǎo)致結(jié)果偏差[2]。對(duì)此，通過(guò)單次單因子法結(jié)合全自動(dòng)定氮儀測(cè)定土壤堿解氮被廣泛應(yīng)用[3]，但單次單因子法只能討論單因素影響，無(wú)法考察各因素間的交互作用，難以得到精準(zhǔn)的測(cè)定結(jié)果。因此，優(yōu)化篩選土壤堿解氮最佳測(cè)定條件尤為重要。

正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)通過(guò)挑選具備了“均勻分散，齊整可比”的代表性點(diǎn)進(jìn)行全面實(shí)驗(yàn)，此法相較于單次單因子法，可分析多因素間存在的交互作用，是一種高效、快速、經(jīng)濟(jì)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法[4]。利用正交實(shí)驗(yàn)結(jié)合定氮儀優(yōu)化土壤堿解氮測(cè)定的最佳條件研究尚未見(jiàn)報(bào)道。為了精確測(cè)定土壤堿解氮，本研究通過(guò)參考LY/T 1228-2015(4)森林土壤氮的測(cè)定，初步確定正交實(shí)驗(yàn)影響堿解氮含量的稱(chēng)樣量、NaOH溶液和蒸餾時(shí)間等因素和水平選擇，最終篩選測(cè)定土壤堿解氮的最佳條件。本文所用實(shí)驗(yàn)方法及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)可望為土壤堿解氮測(cè)定最佳條件篩選提供參考。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 試劑和儀器

試劑：0.01 mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液、40%氫氧化鈉溶液、2%硼酸、鐵粉、混合指示劑(溴甲酚綠∶甲基紅=5∶1)，均為分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心；超純水，自制。

儀器：K1100F全自動(dòng)凱氏定氮儀，海能儀器有限公司；AY120電子天平，島津公司；瑪瑙研磨缽。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 土壤堿解氮的測(cè)定

稱(chēng)取經(jīng)過(guò)孔徑篩的風(fēng)干土壤與1 g鐵粉在瑪瑙研磨缽中均勻研磨后裝入消化管置于定氮儀，將40%氫氧化鈉溶液、2%含有混合指示劑的硼酸溶液、0.01 mol/L標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液和超純水連接定氮儀；并設(shè)置有效參數(shù)進(jìn)行測(cè)試；待消化管內(nèi)的液體呈黑色，蒸餾完全后，用0.01 mol/L的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定接收杯中的餾出液，由藍(lán)色變?yōu)樽霞t色為盡頭，記錄滴定體積。同時(shí)做3次空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 堿解氮含量、絕對(duì)偏差、準(zhǔn)確度及精密度的計(jì)算公式

凱氏定氮法測(cè)定堿解氮含量的允許偏差見(jiàn)表1，土壤堿解氮含量、絕對(duì)偏差、準(zhǔn)確度及精密度計(jì)算公式如下所示。

表1 允許偏差Table 1 Margin of error

d=Ci-Cs

式中：WN為土壤堿解氮的含量，mg/kg；V和V0分別為滴定樣品溶液和空白溶液所用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液的體積，mL；c為鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L；14為氮原子的毫摩爾質(zhì)量，mg/mmol；m為風(fēng)干土壤質(zhì)量，g；d、Ci和Cs分別為堿解氮含量絕對(duì)偏差、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)單次測(cè)量值和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)推薦值，mg/kg；RE和RSD分別為準(zhǔn)確度和精密度，%；n為每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測(cè)量次數(shù)。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

為了準(zhǔn)確測(cè)定土壤堿解氮，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化出最佳測(cè)定條件。合理確定堿解氮測(cè)定的影響因素尤為重要，其中鐵粉、混合指示劑的硼酸和蒸餾水的用量有相對(duì)固定的要求，鐵粉、混合指示劑的硼酸和蒸餾水分別為1 g、15 mL和30 mL。因此，以上三個(gè)影響因素不作考慮。選取稱(chēng)樣量、40% NaOH溶液用量和蒸餾時(shí)間為自變量，參考LY/ T 1228-2015(4)森林土壤氮的測(cè)定確定設(shè)計(jì)三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)多用于多目標(biāo)區(qū)域地球化學(xué)調(diào)查與評(píng)價(jià)、土壤地力調(diào)查與評(píng)價(jià)及生態(tài)環(huán)境研究土壤有效態(tài)樣品分析的量值及質(zhì)量監(jiān)控標(biāo)準(zhǔn)[5]。選取國(guó)家一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW07413a(ASA-2a)重復(fù)析5次，絕對(duì)偏差的平均值為實(shí)驗(yàn)指標(biāo)(Y mg/kg)，最終得到實(shí)驗(yàn)指標(biāo)值越低，則表明單因素的水平條件更優(yōu)。

1.3 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)原理，參照LY/T 1228-2015(4)森林土壤氮的測(cè)定，綜合單因素分析結(jié)果確立正交實(shí)驗(yàn)因素水平，采用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)土壤堿解氮的測(cè)定條件進(jìn)行優(yōu)化篩選，并將最佳實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)影響

2.1.1 稱(chēng)樣量的影響

分別稱(chēng)取1、2、3、4、5 g土壤與1 g的鐵粉研磨混合后置于消化管中，設(shè)置定氮儀的參數(shù)(40%氫氧化鈉溶液45 mL、硼酸15 mL、純水30 mL、蒸餾時(shí)間6 min)進(jìn)行測(cè)試，稱(chēng)樣量對(duì)土壤堿解氮絕對(duì)偏差的影響如圖1所示。

圖1 稱(chēng)樣量對(duì)土壤堿解氮絕對(duì)偏差的影響Fig.1 The effect of weighing sample on the absolute deviation of alkali-hydrolyzabla nitrogen content in soil

由圖1可知，測(cè)得土壤堿解氮的絕對(duì)偏差均在允許偏差(表1)范圍內(nèi)，隨著稱(chēng)樣量的增加絕對(duì)偏差呈現(xiàn)出先降低后升高的趨勢(shì)，當(dāng)稱(chēng)樣量達(dá)到2 g時(shí)絕對(duì)偏差最低，隨后絕對(duì)偏差明顯升高。因此，稱(chēng)樣量的水平應(yīng)設(shè)置為1～3 g。

2.1.2 NaOH溶液用量的影響

稱(chēng)取2 g樣品與1 g還原性鐵粉置于消化管中，設(shè)置凱氏定氮儀的參數(shù)，其中氫氧化鈉溶液用量5、15、25、35、45 mL，其余參數(shù)分別為硼酸15 mL、純水30 mL、蒸餾時(shí)間6 min上進(jìn)行測(cè)試，40% NaOH溶液用量對(duì)土壤堿解氮絕對(duì)偏差的影響如圖2所示。

圖2 40%NaOH溶液用量對(duì)土壤堿解氮絕對(duì)偏差的影響Fig.2 The effect of 40% NaOH solution on the absolute deviation of alkali-hydrolyzabla nitrogen content in soil

由圖2可知，5 mL 40% NaOH溶液時(shí)堿解氮含量的絕對(duì)偏差超出允許偏差(表1)范圍，在15～45 mL時(shí)的絕對(duì)偏差均在允許范圍內(nèi)，用量在15 mL和45 mL時(shí)絕對(duì)偏差相差不大，為了避免不必要的浪費(fèi)，選取40% NaOH溶液用量的水平應(yīng)設(shè)置為15～35 mL。

2.1.3 蒸餾時(shí)間的影響

分別稱(chēng)取1 g樣品與1 g的鐵粉研磨混合后置于消化管中，設(shè)置凱氏定氮儀的參數(shù)，其中蒸餾時(shí)間2、3、4、5、6 min，其余參數(shù)分別為氫氧化鈉溶液用量25 mL、硼酸15 mL、純水30 mL、上進(jìn)行測(cè)試，蒸餾時(shí)間對(duì)土壤堿解氮絕對(duì)偏差的影響如圖3所示。

圖3 蒸餾時(shí)間對(duì)土壤堿解氮絕對(duì)偏差的影響Fig.3 The effect of distillation time on the absolute deviation of alkali-hydrolyzabla nitrogen content in soil

由圖3可知，隨著蒸餾時(shí)間的延長(zhǎng)，土壤堿解氮測(cè)得的絕對(duì)偏差先逐漸減小，在4 min達(dá)到最低值，而后逐漸升高；蒸餾時(shí)間在2 min和6 min時(shí)，絕對(duì)偏差超出允許偏差(表1)范圍。因此，蒸餾時(shí)間的水平應(yīng)設(shè)置為4～5 min。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)分析

2.2.1 實(shí)驗(yàn)因素與水平的確立

依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析可知，設(shè)置實(shí)驗(yàn)因素及水平范圍，列于表2中。其中自變量A、B和C分別為稱(chēng)樣量、NaOH溶液用量和蒸餾時(shí)間。

表2 正交實(shí)驗(yàn)因素水平Table 2 Orthogonal test factor and level setting

2.2.2 正交實(shí)驗(yàn)表安排及實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

采用正交實(shí)驗(yàn)助手軟件對(duì)正交實(shí)驗(yàn)L9(33)結(jié)果(表3)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，建立響應(yīng)值(Y)與稱(chēng)樣量(A)、40% NaOH(aq)用量(B)和蒸餾時(shí)間(C)3個(gè)因素變量之間的關(guān)系，并對(duì)極差進(jìn)行分析。

表3 正交實(shí)驗(yàn)表安排及實(shí)驗(yàn)指標(biāo)分析Table 3 Orthogonal test table arrangement and experiment result analysis

續(xù)表3

通常，極差反應(yīng)各因素水平變化對(duì)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的影響。極差越大，代表著在該因素條件下的水平對(duì)指標(biāo)的影響越大[6]。F比值的大小影響各因素水平實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的判斷。當(dāng)因素的F比值大于F(0.1)臨界值時(shí)，則表明該因素對(duì)實(shí)驗(yàn)影響顯著。由極差分析和F值可得，影響土壤堿解氮含量的因素依次為：40% NaOH溶液mL>蒸餾時(shí)間 min>稱(chēng)樣量g。最佳測(cè)定方法為：A1B2C2，即為稱(chēng)樣量1 g、40% NaOH溶液25 mL和蒸餾時(shí)間4 min。

40% NaOH溶液的用量對(duì)測(cè)得土壤堿解氮含量影響最大，成為準(zhǔn)確測(cè)定土壤堿解氮的關(guān)鍵。測(cè)定堿解氮的原理是通過(guò)堿液處理土壤進(jìn)行水解，它是銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、氨基酸、酰胺和易水解的蛋白質(zhì)的總和。當(dāng)40% NaOH溶液用量過(guò)低或過(guò)高時(shí)，分別造成土壤水解不完全和不屬于堿解氮成分的難水解蛋白質(zhì)發(fā)生部分水解，致使絕對(duì)偏差均發(fā)生偏高現(xiàn)象[7]。

其次，影響土壤堿解氮測(cè)定含的是蒸餾時(shí)間。蒸餾時(shí)間對(duì)土壤溶液在蒸餾的過(guò)程中氨氣是否蒸餾完全產(chǎn)生直接影響，從而致使滴定體積存在明顯偏差。當(dāng)蒸餾時(shí)間為2～3 min時(shí)，由于蒸餾時(shí)間過(guò)短而造成堿解氮含量偏低，樣品中仍有部分未被蒸餾完全的銨態(tài)氮等存在；延長(zhǎng)蒸餾時(shí)間至5～6 min時(shí)，雖能將土壤溶液中銨態(tài)氮等全部蒸餾出來(lái)，但滴定時(shí)間過(guò)長(zhǎng)也會(huì)引起一部分氮元素?fù)p失。因此，蒸餾時(shí)間一般為4 min時(shí)最為適宜。此時(shí)，測(cè)定堿解氮含量的絕對(duì)偏差最小，測(cè)得土壤堿解氮含量最為精確。一般地，當(dāng)蒸餾時(shí)間達(dá)到土壤樣品能夠水解完全時(shí)，適當(dāng)?shù)臏p少蒸餾時(shí)間也可準(zhǔn)確的測(cè)定土壤中的堿解氮含量。

稱(chēng)樣量對(duì)測(cè)定土壤堿解氮含量的影響較小。一般地，稱(chēng)樣量在1～2 g范圍內(nèi)對(duì)堿解氮影響不大，均能準(zhǔn)確測(cè)定堿解氮含量。

2.3 驗(yàn)證土壤堿解氮最佳測(cè)定方法

根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)篩選出土壤全氮最佳測(cè)定方法確定為：稱(chēng)樣量1 g、40% NaOH溶液15 mL和蒸餾時(shí)間4 min。為驗(yàn)證土壤堿解氮最佳測(cè)定方法的可靠性，利用以上最佳測(cè)定方法進(jìn)行10種土壤有效態(tài)成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(ASA系列)重復(fù)進(jìn)行12次堿解氮含量測(cè)實(shí)驗(yàn)證，測(cè)定的土壤堿解氮(如表4所示)均在允許偏差范圍內(nèi)。證明采用正交實(shí)驗(yàn)篩選出的土壤堿解氮最佳測(cè)定方法較為合理。

表4 土壤堿解氮最佳測(cè)定方法的測(cè)定結(jié)果Table 4 The results of the best method for the determination of alkali-hydrolyzabla nitrogen content in soil

3 結(jié) 論

通過(guò)參考LY/T 1228-2015(4)森林土壤氮的測(cè)定，為正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平設(shè)置提供了參考范圍。應(yīng)用正交實(shí)驗(yàn)結(jié)合全自動(dòng)凱氏定氮儀對(duì)土壤堿解氮測(cè)定條件的影響依次為：40% NaOH溶液mL>蒸餾時(shí)間 min>稱(chēng)樣量g。土壤堿解氮最佳測(cè)定方法確定為：稱(chēng)樣量1 g、40% NaOH溶液25 mL和蒸餾時(shí)間4 min。

以最佳測(cè)定方法進(jìn)行土壤成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(ASA系列)驗(yàn)證，測(cè)定的土壤堿解氮均在允許偏差范圍內(nèi)。證明本研究所用實(shí)驗(yàn)方法及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)可用于優(yōu)化土壤堿解氮最佳測(cè)定方法。