劉丹丹,楊婧芳,侯林叢,陸 靜,孫世雯,向霞霞
(1.河南海瑞正檢測技術有限公司,河南鄭州450001;2.安陽市動物衛(wèi)生監(jiān)督所)
動物源性飼料原料在腐敗過程中,由于酶和細菌的作用,蛋白質分解而產生的氨以及胺類等堿性含氮物質被稱作揮發(fā)性鹽基氮(total volatile basic nitrogen,TVB-N)[1~4]。此類物質具有揮發(fā)性,其含量越高,表明氨基酸被破壞的越多,對產品營養(yǎng)價值影響越大[5~7]。
TVB-N 是評價動物源性飼料原料質量和新鮮度的一個重要指標[8~14],已使用該指標在飼料行業(yè)中進行評估動物性飼料原料及其飼料產品的新鮮度,并且魚粉、肉骨粉、血球粉等飼料原料的國家標準[15~17]中規(guī)定了TVB-N 的限量值,因此TVB-N 項目檢測結果就顯得尤為重要[4]。本研究通過對TVB-N檢測過程中關鍵參數進行優(yōu)化,旨在研究出操作簡單、快捷、準確性高、穩(wěn)定性好的檢測方法。
1.1.1 儀器
樣品粉碎機(DFY-200C,溫嶺市林大機械有限公司)、分樣篩(40 目、60 目)、分析天平(感量0.1mg)、數控超聲波清洗器(KQ-250DE 型,昆山市超聲儀器有限公司)、搖床(SHA-C)、電爐、離心機(JW-1042,安徽嘉文儀器裝備有限公司)、酸式滴定管(最小分度值為0.1mL)、錐形瓶(250mL)、容量瓶(50mL)、定氮裝置。
1.1.2 試劑
水(符合GB/T 6682 中三級用水的要求)、高氯酸溶液(0.1mol/L、0.6mol/L、1.2 mol/L)、氫氧化鈉溶液(40g/L)、鹽酸標準溶液(0.01mol/L)、硼酸吸收液(10g/L)、硅油消泡劑、(NH4)2SO4溶液、混合指示劑(甲基紅0.1%乙醇溶液與溴甲酚綠0.5%乙醇溶液等體積混合,臨用前配制)、甲基紅指示劑(10g/L)。
1.2.1 樣品的采集和制備
按照GB/T 14699.1 要求抽取有代表性的飼料原料樣品,用四分法縮減取樣,按照GB/T 20195 制備樣品,粉碎后,分別過40 目、60 目分析篩,混勻,裝入磨口瓶中備用。
1.2.2 樣品處理
稱取試樣5g(精確至0.1mg)于錐形瓶中,分別加浸提試劑40mL,浸提后,將試樣及試樣浸提液完全轉移至50mL 容量瓶,并用浸提液定容,搖勻;取約30mL 試樣浸提液于50mL 離心管中,離心(3 500r/min)5min,取上清液待測(如不能及時檢測,于2℃-6℃的條件下貯存,可保存24h)。
1.2.3 定氮操作
取硼酸吸收液30mL 注入錐形瓶內,加混合指示劑3 滴,并將錐形瓶置于半微量定氮器冷凝管下端,使其下端插入硼酸吸收液的液面下。吸取浸提上清液10mL,注入半微量定氮器反應室內,于蒸汽發(fā)生裝置加入甲基紅指示劑2 滴,在樣品反應裝置中加入硅油消泡劑2 滴和氫氧化鈉溶液10mL,然后迅速加塞,并加水密封,防止漏氣。通入蒸汽進行蒸餾,當餾出液達到150mL 左右時,將冷凝管末端離開吸收液面,繼續(xù)蒸餾1min,用蒸餾水沖洗冷凝管末端,洗液并入錐形瓶內,然后停止蒸餾。
1.2.4 滴定
用鹽酸標準溶液滴定至溶液由藍綠色變成灰紅色為終點,同時,用浸提試劑10mL 代替浸提上清液進行空白試驗。
分別取未粉碎、粉碎過40 目篩和60 目篩的試樣,按上述檢測步驟進行分析,每種處理情況測試5個平行樣品。測試結果見表1。由表1 可知,未粉碎處理的樣品與粉碎過40 目篩、60 目篩樣品相比存在顯著差異(P<0.05);而粉碎至40 目、60 目時樣品處理間差異不顯著(P>0.05)。
表1 不同粉碎粒度對揮發(fā)性鹽基氮檢測結果的影響
在確定了樣品粉碎粒度為40 目的基礎上,研究比較了不同濃度的高氯酸溶液(0.1mol/L、0.6mol/L、1.2 mol/L)對試樣中TVB-N 的提取效果,每種處理情況測試5 個平行樣品,其結果如表2所示。
由表2 可知,隨著高氯酸溶液濃度的增加,樣品浸提液的pH 值逐漸降低,可能存在的微生物和酶活性繼續(xù)腐敗受到抑制,TVB-N 值呈現逐漸降低的趨勢。但提取試劑濃度為0.6mol/L 與1.2 mol/L 樣品提取液pH 值均在2.0 以下,且測定的TVB-N 含量比較穩(wěn)定,說明TVB-N 的提取達到了很好的效果。但從實驗室安全性、節(jié)約成本及環(huán)境友好角度考慮,本研究選擇0.6 mol/L 高氯酸溶液作為提取劑。
表2 不同浸提試劑對揮發(fā)性鹽基氮檢測結果的影響
在確定了樣品粉碎粒度為過40 目篩,浸提試劑為0.6 mol/L 高氯酸溶液基礎上,研究比較了不同浸提方式(超聲浸提、振搖浸提)和時間(10min、20min、30min、40min)對試樣中TVB-N 的提取效果,其結果如表3 所示。
結果表明,超聲波浸提20min 與超聲波浸提30min、振搖浸提30min 或振搖浸提40min 測得樣品中TVB-N 含量差異不顯著(P>0.05)。因此,考慮到節(jié)約時間成本,提高浸提效率,超聲波浸提20min比較合適。
表3 不同浸提方式及時間對揮發(fā)性鹽基氮檢測結果的影響
2.4.1 加標回收試驗
取一定濃度(NH4)2SO4溶液加入魚粉、豬肉粉及雞肉粉中,測定試樣中TVB-N 的含量,每個梯度重復測定5 次,結果見表4。測定的加標回收率在95.11%~105.45%之間,符合檢測要求。
2.4.2 重現性試驗
分別取魚粉、豬肉粉及雞肉粉樣品,測定試樣中TVB-N 的含量,每個樣品重復測定5 次,計算其標準偏差及變異系數,結果見表5。結果表明,該檢測方法重現性好,滿足測定要求。
表4 加標回收試驗結果
表5 精密度測定結果
本試驗結果表明,動物源性飼料原料的粉碎粒度對試樣中TVB-N 的測定結果影響較大,未粉碎處理的樣品與粉碎過40 目篩、60 目篩樣品中TVB-N 的測定結果相比存在顯著差異(P<0.05),原因為粉碎的樣品與浸提試劑接觸面積更大,提高了TVB-N 的浸提效率,使檢測結果更能體現樣品本身的TVB-N 含量;而粉碎至40 目與60 目時樣品處理間差異不顯著(P>0.05),說明粉碎至40 目時,樣品在浸提之后測定的TVB-N 的結果已經相對可靠,能夠體現樣品本身的新鮮度,該研究結果與Wang等[10]研究結果一致。因此,動物源性飼料原料中TVB-N 的數值與樣品的粉碎粒度密切相關,粉碎粒度達到一定程度,有利于TVB-N 的測定。
研究表明,提取試劑的濃度對試樣中TVB-N的測定結果具有一定的影響。本試驗采用0.6mol/L高氯酸溶液作為浸提試劑的原因:一是該試劑可以有效沉淀物源性飼料原料中的蛋白質,有效防止樣品中蛋白質對測定結果的干擾;二是該試劑pH 較低,對酶活有一定的抑制作用,同時具有殺菌和抑菌作用,因此,可以延長待測液保存時間,還可以有效降低由于細菌或酶對樣液中蛋白質的分解對TVB-N 檢測結果的影響。該研究結果與季天榮等[4]研究結果一致,因此,該試劑在一定程度上能保證檢測結果的可靠性。
研究表明,不同浸提方式和浸提時間對檢測結果有一定的影響。試驗結果表明,超聲波浸提20min與超聲波浸提30min、振搖浸提30min 或振搖浸提40min 測得樣品中TVB-N 含量差異不顯著(P>0.05)。本研究采用超聲波浸提20min 進行提取,不僅節(jié)約了時間,提高了工作效率,同時也有效防止因浸提時間過長,導致樣品在浸提過程中產生的進一步腐敗,保證了檢測結果的準確性。
本試驗結果表明,優(yōu)化后的檢測方法測定的魚粉、豬肉粉、雞肉粉中TVB-N 的加標回收率及變異系數均符合相關標準要求,具有較高的準確度和精密度。主要原因:一是在樣品處理時,優(yōu)化法將樣品粉碎達到過40 目篩的標準,選用0.6 mol/L 高氯酸溶液作為浸提劑,提高了樣品與浸提劑的接觸面積,提高了TVB-N 的溶出效率,提高了檢測結果的準確度、可靠性;二是采用超聲波浸提的方式,提高了浸提效率,縮短了提取時間,減少了試驗過程中的前處理因素給試驗結果帶來的影響,進一步提高試驗結果的準確性和重復性。
本試驗通過優(yōu)化動物源性飼料原料中揮發(fā)性鹽基氮的含量測定過程中的關鍵參數,確定了試樣達到過40 目篩的粉碎程度、浸提液選取0.6 mol/L高氯酸溶液、超聲波浸提20min 時,試樣中的揮發(fā)性鹽基氮的檢測結果的準確度高、重現性好。研究表明,該操作方法簡便、快速,有很高的準確度和精密度,適宜于大批量樣品的處理與檢測,應用前景廣闊。