韓英蕾,譚 醉,鄒 勝,黃晴菲*,葉庭洪,王啟衛(wèi)*

(1.中國科學院 成都有機化學研究所，四川 成都 610041；2.中國科學院大學，北京 100049；3.四川大學 華西醫(yī)院 肝臟外科研究室，四川 成都 610041)

成纖維細胞[1]是細胞外基質的重要來源，而細胞外基質的代謝與組織器官的纖維化密切相關。肺纖維化[2-3]是由各種損害引起組織內細胞外基質異常增生和過度沉積的一種病理過程，并最終破壞正常組織結構和功能。肺纖維化以進行性呼吸困難、干咳等為主要癥狀，是以彌漫性的肺泡炎、肺間質炎癥和間質纖維化為組織學特點的一組疾病群；它是導致眾多疾病的重要原因，對人體健康危害極大。近年來，氯硝柳胺主要作為一種潛在抗腫瘤作用的藥物而備受科研工作者的關注[4-9]。但其在抑制成纖維細胞中報道較少，王峻峰等[10]報道了將氯硝柳胺制成鈉鹽、銨鹽或者鋁鹽等，并證實了其可抑制肺纖維細胞的增殖，但其生物利用度較低。

Scheme 1

環(huán)丙基環(huán)在藥物研發(fā)中有很重要的作用，它的引入對藥物的理化性質產生多種影響，包括增加藥效[11]、改善藥物的解離度(pKa)、提高生物利用度[12]、增加血腦屏障透過率[13]、適應目標蛋白質的結合位點[14]、改善分子的極性[15]和溶解度等作用。

本文以氯硝柳胺為先導化合物，以2-位羥基為修飾位點，通過乙酰基連接環(huán)丙基衍生物片段，共設計合成了6個新的氯硝柳胺類衍生物，并對其結構進行1H NMR和HR-MS(ESI)表征。利用化合物8a～8f對小鼠成纖維細胞的體外抗增殖活性進行了考察。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Bruker AVANCE 300 MHz型核磁共振儀(DMSO-d6或CDCl3為溶劑，TMS為內標)；Finnigan LCQDECA質譜儀。

1,1-環(huán)丙基二甲酸二甲酯，98%，上海皓鴻生物醫(yī)藥科技有限公司；氯硝柳胺，98%，上海畢得醫(yī)藥科技有限公司；其余所用試劑均為分析純。

1.2 合成

(1) 1-氨基環(huán)丙基甲酸甲酯鹽酸鹽(1)的合成

將1,1-環(huán)丙基二甲酸二甲酯5.00 g(31.62 mmol)溶于無水乙醇(30 mL)，加入1 mol/L氫氧化鉀溶液(32 mL)，25 ℃反應12 h。濃縮反應液，向反應液加水(30 mL)，二氯甲烷(2×10 mL)萃取，水相用1 mol/L的鹽酸調節(jié)pH至3，二氯甲烷(3×10 mL)萃取，合并有機相，無水硫酸鈉干燥，蒸除溶劑，得1,1-環(huán)丙基二甲酸單甲酯3.64 g，產率80%；1H NMR(300 MHz,CDCl3)δ:11.19(s,1H),3.66(s,3H),1.86～1.45(m,4H)。

氬氣的保護下，將1,1-環(huán)丙基二甲酸單甲酯3.43 g(23.80 mmol)溶于甲苯(25 mL)中，依次加入三乙胺4.30 mL(30.94 mmol)，疊氮磷酸二苯酯5.64 mL(26.18 mmol)，反應2 h，加入芐醇6.20 mL(30.94 mmol)，回流18 h。反應結束冷卻至室溫，加水淬滅反應，蒸除溶劑，用乙酸乙酯(15 mL)溶解，依次用質量分數為10%的鹽酸，飽和碳酸氫鈉溶液，飽和食鹽水洗滌，收集有機相，經無水硫酸鈉干燥，蒸除溶劑，殘余物經硅膠柱層析(洗脫劑：石油醚/乙酸乙酯=10/1，V/V)純化得白色固體1-(芐氧羰基氨基)環(huán)丙烷-1-甲酸甲酯3.69 g，產率62 %。

氫氣保護下，將1-(芐氧羰基氨基)環(huán)丙烷-1-甲酸甲酯2.40 g(9.63 mmol)溶于甲醇(40 mL)和四氫呋喃(40 mL)的溶液中，加入10% Pd/C(150 mg)，室溫攪拌6 h。硅藻土過濾反應液，甲醇洗滌，將濾液和洗滌液合并濃縮，加入2 mol/L鹽酸的乙酸乙酯溶液(10 mL)攪拌5 h，重結晶得白色固體978 mg，產率67%;1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:8.99(s,3H),3.71(s,3H),1.56～1.18(m,4H)。

(2) 1-(叔丁氧基羰基氨基)環(huán)丙烷-1-甲酸甲酯(2)的合成

將18.00 g(52.78 mmol)溶于甲醇(40 mL)中，置于冰水浴中，加入三乙胺11.21 g(110.83 mmol)，滴加二碳酸二叔丁酯12.67 g(58.06 mmol)，室溫下反應20 h(TLC監(jiān)測)。將反應液濃縮，加入1 mol/L的鹽酸溶液(2 eq.)，二氯甲烷(3×30 mL)萃取，合并有機相，飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，蒸除溶劑，得到白色固體8.96 g，產率79%,m.p.81.7～82.9 ℃;1H NMR(300 MHz,CDCl3)δ:5.12(s,1H),3.69(s,3H),1.51(d,J=2.7 Hz,2H),1.44(s,9H),1.16(s,2H)。

(3) 1-(叔丁氧基羰基氨基)環(huán)丙烷-1-甲酸(3)的合成

0 ℃下，將21.00 g(4.65 mmol)加入到四氫呋喃/水/甲醇(4 mL/2 mL/2 mL)的溶液中，加入氫氧化鋰0.56 g(23.22 mmol)，室溫下反應12 h(TLC監(jiān)測)。將反應液旋干，加水4 mL，用1 mol/L的鹽酸溶液調節(jié)pH至4，用甲基叔丁基醚(3×10 mL)萃取，合并有機相，經無水硫酸鈉干燥，蒸除溶劑，得到白色固體925 mg，產率99%，m.p.172.6～173.8 ℃;1H NMR(300 MHz,CDCl3)δ:5.14(s,2H),1.58(s,2H),1.45(s,9H),1.23(d,J=9.1 Hz,2H);13C NMR(75 MHz,CDCl3)δ:178.96,155.91,80.04,34.19,28.22,18.23。

(4)4d～4f的合成(以4d為例)

冰水浴下，將3100 mg(0.49 mmol)溶解于二氯甲烷(1 mL)中，向其中加入EDCI 191 mg(0.98 mmol)，滴加芐胺99 μL(0.79 mmol),DMAP 73 mg(0.59 mmol)，室溫反應16 h。將反應液旋干，乙酸乙酯(6 mL)溶解，分別用1 mol/L的鹽酸溶液，飽和碳酸氫鈉溶液，飽和食鹽水洗滌，合并有機相，經無水硫酸鈉干燥，蒸除溶劑，得到產物。

4d:白色固體,產率79%,135.3～136.1 ℃;1H NMR(300 MHz,CDCl3)δ:8.77(s,1H),7.83(s,1H),7.61(d,J=7.0 Hz,1H),7.44～7.17(m,2H),5.75(s,1H),1.71～1.53(m,2H),1.43(s,9H),1.08(d,J=2.5 Hz,2H)。

4e:白色固體,產率87%,167.9～169.8 ℃;1H NMR(300 MHz,CDCl3)δ:8.52(s,1H),7.43(d,2H),7.25(d,2H),5.34(s,1H),1.63(q,J=4.7 Hz,2H),1.46(s,9H),1.08(q,J=4.7 Hz,2H)。

4f:灰白色固體,產率86%,140.0～141.2 ℃;1H NMR(300 MHz,CDCl3)δ:8.49(s,1H),7.61(s,1H),7.51(dt,J=7.6 Hz,2.1 Hz,1H),7.29～7.17(m,2H),5.38(s,1H),3.05(s,1H),1.63(q,J=4.7 Hz,2H),1.46(s,9H),1.08(q,J=4.7 Hz,2H)。

(5)5d～5f的合成通法

將化合物4(1.47 mmol)溶于二氯甲烷(4 mL)中，加入三氟乙酸(2 mL)，室溫反應2 h，向反應瓶中緩慢加入飽和碳酸氫鈉溶液，直至沒有氣泡產生，分液，二氯甲烷(3×5 mL)萃取，合并有機相，經無水硫酸鈉干燥，蒸除溶劑，得到的產物直接用于下一步反應。

(6)6a,6c～6f的合成通法

冰水浴下，將化合物7(1.47 mmol)溶于二氯甲烷(2 mL)中，加入三乙胺0.21 mL(1.47 mmol)，緩慢滴加溴乙酰溴(1.47 mmol)，攪拌15 min(TLC監(jiān)測)，加水(6 mL)，用二氯甲烷(3×3 mL)萃取，合并有機相，用飽和食鹽水(3 mL)洗滌，經無水硫酸鈉干燥，蒸除溶劑，殘余物經硅膠柱層析(洗脫劑：石油醚/乙酸乙酯=2/1，V/V)純化得化合物。

6a:白色固體，產率68%;1H NMR(300 MHz,CDCl3)δ:6.66(s,1H),3.83(d,J=2.2 Hz,2H),2.71(tq,J=7.2 Hz,3.8 Hz,1H),0.91～0.67(m,2H),0.55(ddd,J=6.9 Hz,5.3 Hz,3.8 Hz,2H)。

6c:白色固體，產率49%;1H NMR(300 MHz,CDCl3)δ:6.86(s,1H),3.82(s,2H),3.21(td,J=7.1 Hz,5.7 Hz,2H),1.57～1.38(m,2H),1.39～1.17(m,2H),0.86(t,J=7.3 Hz,3H)。

6d:白色固體，產率52%;1H NMR(300 MHz,CDCl3)δ:8.64(s,1H),7.79(d,J=2.0 Hz,1H),7.64～7.56(m,1H),7.46～7.28(m,3H),3.85(s,2H),1.65(q,J=5.0 Hz,2H),1.11(q,J=5.0 Hz,2H).

6e:白色固體，產率52%;1H NMR(300 MHz,Methanol-d4)δ:7.56～7.36(m,2H),7.13～6.97(m,2H),3.90(s,2H),1.57(q,J=4.6 Hz,2H),1.10(q,J=4.6 Hz,2H)。

6f:白色固體，產率69%;1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:9.51(s,1H),8.87(s,1H),7.70(s,1H),7.65(d,J=8.3 Hz,1H),7.33(t,J=7.9 Hz,1H),7.18(d,J=7.6 Hz,1H),4.17(s,1H),3.92(s,2H),1.41(q,J=4.4 Hz,2H),0.96(q,J=4.4 Hz,2H)。

(7)6b的合成

冰水浴下，將鹽酸甲胺600 mg(8.88 mmol)溶解于二氯甲烷(15 mL)中，加入碳酸鉀2.45 g(17.76 mmol)，緩慢滴加溴乙酰溴0.78 mL(8.88 mmol)，攪拌至15 ℃反應3 h，向反應液中加入水(30 mL)，二氯甲烷(3×15 mL)萃取，合并有機相，用飽和食鹽水(15 mL)洗滌，經無水硫酸鈉干燥，蒸除溶劑，殘余物經硅膠柱層析(洗脫劑：石油醚/乙酸乙酯=2/1，V/V)純化得310 mg無色油狀液體，產率23%;1H NMR(300 MHz,CDCl3)δ:6.56(s,1H),3.89(s,2H),2.87(d,J=4.9 Hz,3H)。

(8)8a～8f的合成通法

將化合物6(0.85 mmol)溶于乙腈(15 mL)中，加入碳酸鉀235 mg(1.70 mmol)，氯硝柳胺277 mg(0.85 mmol)，反應3 h(TLC監(jiān)測)。減壓濃縮，殘余物經硅膠柱層析(洗脫劑：石油醚/乙酸乙酯=1/2，V/V)純化得化合物。

8a:白色固體，產率19%;1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:10.86(s,1H),8.63(d,J=9.2 Hz,1H),8.43(d,J=2.6 Hz,1H),8.37(s,1H),8.29(dd,J=9.2 Hz,2.6 Hz,1H),7.93(d,J=2.8 Hz,1H),7.66(dd,J=9.0 Hz,2.8 Hz,1H),7.19(d,J=9.0 Hz,1H),4.88(s,2H),2.63(dq,J=7.1 Hz,3.5 Hz,1H),0.61(dd,J=7.1 Hz,2.3 Hz,2H),0.47～0.24(m,2H);HR-MS(ESI)m/z:Calcd for C18H15N3O5Cl2Na{[M+Na]+}446.0286,found 446.0278。

8b:白色固體，產率23%;1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:10.88(s,1H),8.66(d,J=9.2 Hz,1H),8.43(d,J=2.6 Hz,1H),8.36～8.16(m,2H),7.95(d,J=2.8 Hz,1H),7.67(dd,J=8.9 Hz,2.8 Hz,1H),7.19(d,J=9.0 Hz,1H),4.94(s,2H),2.61(d,J=4.6 Hz,3H);HR-MS(ESI)m/z:Calcd for C16H13N3O5Cl2Na{[M+Na]+}420.0130,found 420.0118。

8c:白色固體，產率34%;1H NMR(300 MHz,CDCl3)δ:10.27(s,1H),8.89(d,J=9.3 Hz,1H),8.34(d,J=2.6 Hz,1H),8.23(dd,J=9.2 Hz,2.5 Hz,1H),8.15(d,J=2.8 Hz,1H),7.51(dd,J=8.8 Hz,2.8 Hz,1H),6.95(d,J=8.8 Hz,1H),6.39(s,1H),4.80(s,2H),3.34(q,J=6.7 Hz,2H),1.46(q,J=7.5 Hz,2H),1.35～1.19(m,2H),0.88(t,J=7.3 Hz,3H);HR-MS(ESI)m/z:Calcd for C19H19N3O5Cl2Na{[M+Na]+}462.0599,found 462.0587。

8d:白色固體，產率16%;1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:10.83(s,1H),9.76(s,1H),8.89(s,1H),8.61(d,J=9.1 Hz,1H),8.34(d,J=2.6 Hz,1H),8.28(dd,J=9.1 Hz,2.6 Hz,1H),7.94(d,J=2.9 Hz,2H),7.90(d,J=8.7 Hz,1H),7.64(dd,J=8.9 Hz,2.9 Hz,1H),7.55(t,J=7.9 Hz,1H),7.42(d,J=7.7 Hz,1H),7.35(d,J=9.0 Hz,1H),5.06(s,2H),1.41(d,J=3.4 Hz,2H),0.98(d,J=3.4 Hz,2H);HR-MS(ESI)m/z:Calcd for C26H19N4O6F3Cl2Na{[M+Na]+}633.0531,found 633.0523。

8e:白色固體，產率15%;1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:10.83(s,1H),9.49(s,1H),8.86(s,1H),8.61(d,J=9.2 Hz,1H),8.41(d,J=2.7 Hz,1H),8.29(dd,J=9.1 Hz,2.7 Hz,1H),7.94(d,J=2.8 Hz,1H),7.67(dd,J=9.0 Hz,2.8 Hz,1H),7.52(dd,J=8.9 Hz,5.1 Hz,2H),7.31(d,J=9.0 Hz,1H),7.15(t,J=8.8 Hz,2H),5.03(s,2H),1.49～1.24(m,2H),0.93(q,J=4.4 Hz,2H);HR-MS(ESI)m/z:Calcd for C25H19N4O6FCl2Na{[M+Na]+}583.0563,found 583.0546。

8f:白色固體，產率20%;1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:10.81(s,1H),9.48(s,1H),8.86(s,1H),8.60(d,J=9.2 Hz,1H),8.36(d,J=2.7 Hz,1H),8.28(dd,J=8.9 Hz,2.7 Hz,1H),7.94(d,J=2.8 Hz,1H),7.73～7.57(m,3H),7.32(dd,J=8.7 Hz,5.8 Hz,2H),7.17(d,J=7.5 Hz,1H),5.04(s,2H),4.17(s,1H),1.39(q,J=4.7 Hz,2H),0.95(q,J=4.7 Hz,2H);HR-MS(ESI)m/z:Calcd for C27H20N4O6Cl2Na{[M+Na]+}589.0658,found 589.0649。

1.3 體外抗纖維活性測試

采取MTT法測試目標化合物8a～8f的體外抗纖維化活性。選取小鼠成纖維細胞(3T3)，以氯硝柳胺為陽性對照。取對數生長期的3T3細胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔1300個細胞，100 μL/孔，置37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。設置空白對照組(不含藥物的培養(yǎng)基)和陽性藥物組(10 μmol/L)，8a～8f化合物濃度為10 μmol/L，設5個復孔，在CO2培養(yǎng)箱(37 ℃,5%CO2)中培養(yǎng)72 h。每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，再繼續(xù)培養(yǎng)3 h，去除上清液，每孔加入150 μL DMSO，震蕩 5 min使甲臜顆粒溶解，酶標儀測定 492 nm 波長處光吸收值，計算目標化合物8a～8f對成纖維細胞的抑制率。

使用待測化合物8a～8f對小鼠的成纖維細胞的抑制率來評價待測化合物體外抑制強度，氯硝柳胺(Niclosamide)作為陽性對照。8a～8f對3T3細胞的抑制率值見表1。由表可知，對于合成的目標化合物活性評價結果顯示，在10 μmol/L的藥物濃度下，設計合成的氯硝柳胺衍生物(8a～8f)表現出了一定的抗肺纖維化活性。環(huán)丙基修飾的化合物8a表現出最好的活性，其抑制率達到84.25%，較未經修飾的氯硝柳胺(抑制率75.76%)顯示出更好的效果。將環(huán)丙基替換為甲基(8b)和丁基(8c)，其活性顯著降低，抑制率分別為26.90%和18.05%。說明環(huán)丙基在提高氯硝柳胺的抗纖維化活性中具有重要作用。這可能是因為環(huán)丙基取代基比甲基和丁基具有更好的穩(wěn)定性，有利于提高分子的代謝穩(wěn)定性[16-18]。但在環(huán)丙基上引入較大的基團時(8d～8f)，其抗肺纖維化活性會有一定降低，可能是位阻較大的原因。

表1 8a～8f 對小鼠成纖維細胞作用72小時的抑制率Table 1 Summary of in vitro inhibitory activities of 8a～8f against 3T3 cells in 72 h

設計合成了6個新的氯硝柳胺類衍生物(8a～8f)，并通過對小鼠成纖維細胞的體外抑制率，初步評價其抗肺纖維化活性。結果顯示，獲得了一個具有較好活性的環(huán)丙基修飾的氯硝柳胺類衍生物，其抑制率高于陽性對照氯硝柳胺。