王 艷，謝道俊，儲(chǔ)丹晨，韋 彪，孫愘叡，丁偉軍，鮑婷婷，王秋燁，趙志勇，王玉嬌，鮑遠(yuǎn)程

（亳州市中醫(yī)院，安徽 亳州 236800）

血管性癡呆（vascular dementia，VaD）是指由于腦血管疾病所導(dǎo)致的認(rèn)知損害，VaD發(fā)病機(jī)制一般認(rèn)為是腦血管病的病灶涉及額葉、顳葉及邊緣系統(tǒng)，或病灶損害了足夠容量的腦組織，導(dǎo)致記憶、注意、執(zhí)行功能和語(yǔ)言等高級(jí)認(rèn)知功能的嚴(yán)重受損［1］。VaD的神經(jīng)生化機(jī)制分類(lèi)繁多，機(jī)制復(fù)雜，主要有膽堿能通路受損、突觸損傷、淀粉樣蛋白沉積、內(nèi)皮素-1和降鈣素代謝紊亂、興奮性氨基酸受體激活所導(dǎo)致的細(xì)胞損傷、單胺類(lèi)遞質(zhì)代謝紊亂等，此外還與炎癥、自身免疫、遺傳等相關(guān)。腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子（brain-derived neurotropic factors，BDNF）、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及突觸可塑性的改變與腦組織損傷后的修復(fù)有關(guān)，其中突觸可塑性的損傷與血管性癡呆發(fā)病的相關(guān)性越來(lái)越引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注［2-3］。本研究采用永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈的方法制作血管性癡呆大鼠模型，觀察黃蒲通竅膠囊對(duì)VaD大鼠海馬CA1區(qū)突觸超微結(jié)構(gòu)的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)雄性健康Wistar大鼠，體質(zhì)量200～230 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002，月齡8周，適應(yīng)性喂養(yǎng)2周。

1.2 試藥 多奈哌齊［國(guó)藥準(zhǔn)字H20050978，衛(wèi)材（中國(guó)）藥業(yè)有限公司生產(chǎn)］；黃蒲通竅膠囊由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供（皖藥制字Z20080006，批號(hào)20120618）。

1.3 儀器 JEM-1230型透射電子顯微鏡鏡（JEOL日本產(chǎn)）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 模型制備 采用永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈（bi?lateral cervical vessels occlusion，2-VO）［4］的 方 法 制作血管性癡呆大鼠模型。大鼠術(shù)前12 h禁食，自由飲水，用3.5%水合氯醛0.1 ml/kg腹腔注射麻醉大鼠，將大鼠仰臥固定于自制的大鼠手術(shù)操作木板上，頸部皮膚剪毛備皮，碘伏常規(guī)消毒，酒精棉球脫碘。切口位于頸正中線處，長(zhǎng)約1 cm，鈍性分離皮下組織后，于切口正下方的斜方肌與氣管夾角處可見(jiàn)左側(cè)頸總動(dòng)脈搏動(dòng)，分離出左側(cè)頸總動(dòng)脈后，以4號(hào)絲線遠(yuǎn)近端雙重結(jié)扎，從中剪斷，然后右側(cè)操作同左側(cè)。術(shù)中動(dòng)作輕柔，避免鉗夾和過(guò)分牽拉迷走神經(jīng)，注意無(wú)菌原則，行逐層間斷縫合，術(shù)后放入保溫的鼠籠（電熱毯保溫），待大鼠清醒后，放回動(dòng)物籠架上單籠飼養(yǎng)，予自由進(jìn)食進(jìn)水，術(shù)后每天以碘酒消毒傷口及周?chē)つw，連續(xù)5 d。假手術(shù)對(duì)照組：雙側(cè)頸總動(dòng)脈不結(jié)扎，余同模型組。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組與處理 將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后進(jìn)行分組，用計(jì)算機(jī)隨機(jī)發(fā)生器隨機(jī)分為5組，即血管性癡呆模型組（簡(jiǎn)稱(chēng)“模型組”）22只、多奈哌齊+模型組（簡(jiǎn)稱(chēng)“多奈哌齊組”）22只、黃蒲通竅膠囊中劑量+模型組（簡(jiǎn)稱(chēng)“黃蒲通竅組”）22只、假手術(shù)組12只、正常對(duì)照組12只。各組大鼠術(shù)后24 h給予相應(yīng)灌胃，正常對(duì)照組、假手術(shù)組及模型組給予生理鹽水灌胃，劑量為5.0 ml/（kg·d）；多奈哌齊組給予多奈哌齊溶液0.63 mg/（kg·d）灌胃，連續(xù)45 d；黃蒲通竅膠囊組給予黃蒲通竅溶液1.51 g/（kg·d），連續(xù)灌胃45 d。末次用藥24 h后將大鼠斷頭取腦，進(jìn)行免疫組化及突觸超微結(jié)構(gòu)觀察。

2.3 突觸超微結(jié)構(gòu)觀察 用日產(chǎn)JEM-1230型透射觀察攝片，并選擇有意義的拍片保存，以Image-Pro?Plus 6.0圖像分析軟件對(duì)突觸界面參數(shù)進(jìn)行分析。突觸界面率的測(cè)量參照J(rèn)ONES等［5］方法，即界面曲率=突觸界面弧長(zhǎng)a/弦長(zhǎng)b。突觸活性帶長(zhǎng)度與突觸后膜致密物（post synaptic density，PSD）厚度參照GULDNER［6］方法進(jìn)行測(cè)量，突觸間隙寬度用多點(diǎn)平均法測(cè)定。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間變量比較用單因素方差分析（One-Way ANOVA），方差齊時(shí)，兩組間比較采用LSD-t（least significant dif?ference）檢驗(yàn)；方差不齊時(shí)，選用 Dunnett’s T3（3）檢驗(yàn)。P<0.05時(shí)表示有顯著性差異，P<0.01時(shí)表示有極顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 各組突觸超微結(jié)構(gòu)電鏡觀察結(jié)果 見(jiàn)圖1。正常組及假手術(shù)組：突觸較密集，突觸前后膜、突觸間隙和突觸囊泡清晰可分辨，突觸前膜內(nèi)可見(jiàn)均勻的小泡，突觸后膜致密區(qū)染色深，物質(zhì)密度大。模型組：突觸結(jié)構(gòu)有融合現(xiàn)象，前后膜模糊，突觸后致密帶變薄，密度低，突觸囊泡不清晰，可見(jiàn)突觸間隙變窄，突觸活性帶較短，神經(jīng)元水腫，胞體固縮濃染，突起膜有的發(fā)生斷裂溶解。黃蒲通竅組及多奈哌齊組：神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)尚完整，突觸前成分內(nèi)的突觸小泡可見(jiàn)，突觸小泡數(shù)量增多，在突觸前膜和后膜處均可見(jiàn)深染物質(zhì)，以突觸后膜處更明顯，突觸后致密物變厚，突觸間隙不清晰，結(jié)構(gòu)有融合現(xiàn)象。

圖1 各組突觸超微結(jié)構(gòu)電鏡觀察圖 （×30 k）

3.2 各組突觸超微結(jié)構(gòu)參數(shù)比較 見(jiàn)表1。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，各組突觸間隙無(wú)明顯差異（P>0.05）；與模型組比較，黃蒲通竅組PSD厚度、突觸界面曲率和活性帶長(zhǎng)度均顯著增加（P<0.01），與多奈哌齊組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

表1 各組突觸超微結(jié)構(gòu)參數(shù)的比較 （±s）

表1 各組突觸超微結(jié)構(gòu)參數(shù)的比較 （±s）

注：與正常對(duì)照組及假手術(shù)組比較，①P<0.05，②P<0.01；與模型組比較，③P<0.01

組 別正常對(duì)照組假手術(shù)組模型組黃蒲通竅膠囊組多奈哌齊組n 12 12 22 22 22活性帶長(zhǎng)度（nm）359.4±17.25 359.6±15.36 156.5±36.84②385.8±19.54③388.9±22.99③突觸界面曲率1.1±0.16 1.0±0.14 0.8±0.15①1.2±0.19③1.2±0.18③突觸間隙（nm）23.0±4.50 23.6±6.50 23.9±5.84 24.2±5.46 25.9±3.93 PSD厚度（nm）58.3±14.66 55.2±13.83 34.2±10.41②69.9±9.23③67.9±10.27③

4 討論

突觸（synapse）一詞最早由英國(guó)神經(jīng)生理學(xué)家謝靈頓（SHERRINGTON）于1897年提出。Synapse原意為“握手”“連接”之意，確切地說(shuō)突觸就是一個(gè)特化的接觸點(diǎn)，通過(guò)這個(gè)點(diǎn)，信息從一個(gè)神經(jīng)元傳向另一個(gè)神經(jīng)元，或從一個(gè)神經(jīng)元傳向一個(gè)效應(yīng)細(xì)胞。按信息傳遞方式的不同，突觸分為電突觸和化學(xué)性突觸，化學(xué)性突觸的信號(hào)傳遞容易受環(huán)境因素的影響，其傳遞效率不固定，這就為突觸可塑性奠定了生理學(xué)基礎(chǔ)。為了適應(yīng)環(huán)境，神經(jīng)系統(tǒng)回路在整個(gè)生命過(guò)程中都是可修飾的，稱(chēng)為可塑性（plasticity），包括結(jié)構(gòu)和功能兩方面的變化，前者包括突觸連接的形成與消退、突觸活性區(qū)數(shù)量與面積的改變、突觸間隙變化以及各種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改變等；后者主要表現(xiàn)為突觸傳遞功能的增強(qiáng)或減弱，如短時(shí)程和長(zhǎng)時(shí)程改變，長(zhǎng)時(shí)程改變包括：長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（long-term po?tentiation,LTP）和長(zhǎng)時(shí)程壓抑（long-term depression）；短時(shí)程改變包括：突觸易化（synaptic facilitation）、突觸壓抑（synaptic depression）和突觸強(qiáng)化（synaptic po?tentiation）。其中，突觸界面曲率、PSD厚度、活性帶長(zhǎng)度是反映突觸結(jié)構(gòu)可塑性的敏感指標(biāo)［7-8］。

中醫(yī)古籍中有關(guān)癡呆的專(zhuān)論較少，多歸屬于“癡呆”“呆病”“呆癡”“呆傻”“健忘”等范疇，其基本病機(jī)為髓海不足，神機(jī)失用。由陰精氣血虧損不足，髓海失充，腦失所養(yǎng)，或氣、火、痰、瘀諸邪內(nèi)阻，上擾清竅所致，病位在腦，與心、肝、脾、腎功能失調(diào)密切相關(guān)［9］，本病臨床病機(jī)特點(diǎn)以正虛為主，兼有虛實(shí)夾雜，單純實(shí)證較少見(jiàn)，證型有腎虛髓虧、肝腎陰虛、痰蒙清竅、瘀阻清竅、心肝火旺、心脾兩虛、氣虛血瘀等。近年來(lái)，大量的研究表明腎精虧虛、瘀血阻絡(luò)、痰濁阻竅為多見(jiàn)，且單一證候少見(jiàn)，多是兩種以上證候的組合。痰濁蒙竅證、瘀阻腦絡(luò)證、腑滯濁留證在血管性認(rèn)知障礙（VCI）患者中出現(xiàn)頻率高、程度嚴(yán)重，其可能是VCI發(fā)病的危險(xiǎn)因素［10-12］。黃蒲通竅膠囊是基于多年臨床實(shí)踐總結(jié)出來(lái)的治療血管性癡呆的院內(nèi)制劑，由石菖蒲、益智仁、制何首烏、川芎、大黃、人參等組方而成，具有益氣活血、化痰開(kāi)竅作用。前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，黃蒲通竅膠囊能夠上調(diào)腦缺血后c-fos表達(dá)，下調(diào)腦組織核因子-κB（BNF-κB）的表達(dá)，產(chǎn)生腦保護(hù)和抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用，通過(guò)Fas信號(hào)通路抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡而起到改善記憶和認(rèn)知功能的作用，臨床試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)該藥具有明顯改善血管性認(rèn)知功能障礙患者智能積分（ADAS-cog），并且能夠提高血管性癡呆患者的血清生長(zhǎng)抑素、精氨酸加壓素水平，降低血清中NO、NOS的含量［13-17］。

本研究中，我們觀察到模型組大鼠的PSD厚度、突觸界面曲率、活性帶長(zhǎng)度明顯小于正常對(duì)照組，而黃蒲通竅組PSD厚度、突觸界面曲率和活性帶長(zhǎng)度與模型組比較均顯著增加。神經(jīng)遞質(zhì)主要在神經(jīng)元胞體或軸突末梢的胞漿內(nèi)合成，儲(chǔ)存在突觸前的突觸小泡內(nèi)，當(dāng)神經(jīng)沖動(dòng)抵達(dá)神經(jīng)末梢時(shí)，末梢的動(dòng)作電位和離子轉(zhuǎn)移，Ca2+由膜外進(jìn)入膜內(nèi)，一定數(shù)量的囊泡膜與突觸前膜融合，囊泡內(nèi)的內(nèi)容物就釋放到突觸間隙，與突觸后膜上的相應(yīng)受體結(jié)合；發(fā)揮作用后，神經(jīng)遞質(zhì)會(huì)在突觸間隙內(nèi)被及時(shí)清除，以利于下一輪的突觸傳遞。而突觸界面曲率的增加，有利于遞質(zhì)與后膜上的受體充分結(jié)合，而活性帶長(zhǎng)度和PSD是突觸興奮性增高的標(biāo)志，能使突觸的傳遞效能增加，因?yàn)镻SD厚度的增加和活性帶長(zhǎng)度的延長(zhǎng)有助于下游信號(hào)的傳遞。而突觸間隙的增大，會(huì)使遞質(zhì)到達(dá)突觸后膜的時(shí)間延長(zhǎng)，增加了遞質(zhì)失活的機(jī)會(huì)，從而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞興奮性的改變。而本實(shí)驗(yàn)中，我們尚未觀察到突觸間隙的改變。

綜上所述，與學(xué)習(xí)記憶有關(guān)的腦區(qū)內(nèi)突觸超微結(jié)構(gòu)，可因不同的生理病理狀態(tài)而發(fā)生變化，黃蒲通竅膠囊具有增加突觸界面曲率和PSD厚度、延長(zhǎng)活性帶長(zhǎng)度的作用，這些可能是黃蒲通竅膠囊改善VaD大鼠學(xué)習(xí)記憶的作用機(jī)制。