張莘，王統(tǒng)苗，劉本帥，江勇，白皓，張揚，王志秀，陳國宏,常國斌

(1.揚州大學動物科學與技術學院，江蘇 揚州 225009；2.揚州大學農業(yè)科技發(fā)展研究院，教育部農業(yè)與農產品安全國際合作聯(lián)合實驗室，江蘇 揚州 225009)

FMO3基因屬于黃素單加氧酶家族(FMOs)，F(xiàn)MOs是酶的多態(tài)性家族，存在于光滑的內質網中，其催化軟親核雜原子物質氧化成它們各自的氧化物[1-3].FMO3是FMOs在成人肝臟中的主要存在形式，對叔胺如三甲胺(TMA)有獨特的底物偏好，且機體內TMA氧化為無氣味的三甲胺N-氧化物(TMAO)的代謝過程主要由FMO3調節(jié)，在肝臟和腎臟中進行[4-7].有研究表明TMAO以及TMAO前體如膽堿會在慢性腎病患者中累積且是尿毒癥的毒素[8-9]，且TMAO被確定為腎病患者的心血管危險因素[10].FMO3的調節(jié)直接影響全身TMAO水平，血小板反應性和體內血栓形成速率，與動脈粥樣硬化有關[11].一些動物產品也存在由于來源中含有過量的TMA，因此呈“魚腥味”“腥味”等[12]，表明牛奶中的魚腥味是由牛FMO3外顯子6中的無義突變(R238X)導致該密碼子變?yōu)榻K止密碼子引起FMO3活性缺失；許多家禽物種中也發(fā)現(xiàn)了FMO3突變與蛋黃中TMA水平升高和畜產品的魚腥味之間的有顯著關聯(lián)，如雞[13]、鵪鶉[14]、鵝[15].有研究報道TMA與食物的新鮮程度有緊密聯(lián)系，是產生魚腥臭味的主要物質[14].TMA、TMAO和膽堿由膳食磷脂酰膽堿產生，磷脂酰膽堿在高脂肪食物中含量豐富[16-17].目前，國內外關于鴨FMO3基因的相關報道較少，而FMO3基因在鴨上的研究對其抗病育種和畜產品魚腥味有重要意義，同時鴨肉又是我國的重要畜產品之一.目前世界上飼養(yǎng)的肉鴨品種以北京鴨及在其基礎上選育的品種(‘櫻桃谷北京鴨’)為主.鴨具有生長快、瘦肉率高、凈肉率高和飼料轉化率高，以及抗病力強等優(yōu)點.本研究通過飼喂鴨2種動物油脂含量不同的飼料，對鴨的FMO3基因第二、六、七外顯子的多態(tài)性進行檢測，qPCR法檢測肝臟、腎臟中FMO3基因的表達，對鴨FMO3基因多態(tài)和動物油脂與FMO3基因在肝、腎中的表達進行關聯(lián)分析研究，旨在為FMO3基因的表達調控提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 79只0日齡的‘櫻桃谷鴨’購自益客集團.

1.1.2 試驗試劑 無油脂飼料、動物油脂均購自益客集團；Trizol和反轉錄PCR試劑盒Prime Script TMRT reagent Kit購自天根生化科技有限公司；qPCR試劑盒購自諾維贊公司.

1.2 動物飼養(yǎng)

本試驗的鴨在益客集團采用網上平養(yǎng)的方式進行飼養(yǎng)，將79只0日齡鴨平均分為A、B 2組，每組雌雄各半，前2周均使用不含動物油脂的飼料進行育雛，第3周開始，A組繼續(xù)飼喂不含動物油脂的飼料，B組飼喂含10%的動物油脂的飼料，到上市日齡(42日齡)時屠宰.

1.3 DNA提取

在鴨28日齡時，用苯酚和氯仿法提取基因組DNA，選擇完整性好(無拖尾現(xiàn)象)，D260/D280介于1.8～2.0之間的DNA樣品稀釋至50 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆?

1.4 基因分型

Wang等[18]的研究表示FMO3的錯義突變發(fā)生在第二外顯子、第六外顯子和第七外顯子.所以本研究根據NCBI上北京鴨FMO3的基因序列設計引物(表1)，引物合成由北京擎科生物技術有限責任公司進行.運用PCR技術擴增FMO3第二、第六和第七外顯子，將PCR產物送測序公司進行測序.采用MEGA6軟件對不同個體測序片段進行序列比對，并結合MEGA6軟件對差異堿基測序圖進行比較分析，去除可能存在的誤判，確定突變位點基因型，計算基因型頻率和基因頻率.

表1 鴨FMO3基因錯義突變檢測引物

1.5 鴨FMO3基因表達量的測定

利用實時定量PCR法檢測肝臟、腎臟中FMO3基因的表達.鴨42日齡時采肝臟、腎臟置于RNA保護液中，-80℃保存.AA和AG基因型，每組五雄五雌，GG基因型每組4只，做肝臟、腎臟中的相對定量分析.細胞總RNA的提取采用Trizol法按說明進行，將D260/D280介于1.9～2.0之間的RNA濃度稀釋至500 ng/μL，-80 ℃保存?zhèn)溆?反轉錄PCR采用試劑盒按說明進行，實時定量PCR采用試劑盒按說明進行.引物序列見表2.

表2 鴨FMO3基因及內參GADPH mRNA熒光實時定量PCR引物

針對FMO3基因表達及內標基因GAPDH，每次反應中，每個樣本重復3次，最后取平均值，每個樣本的相對表達量的值等于目的基因的表達量的值除以GAPDH的表達量均值，肝臟組織目的基因的相對表達量采用2-△△Ct方法計算試驗原始數(shù)據.個體樣本之間的表達差異用IBM SPSS Statistics22統(tǒng)計軟件進行多重比較.

2 結果與分析

2.1 鴨FMO3錯義突變基因分型

用表1中的引物對鴨基因序列進行擴增，經檢測PCR產物好，特異性好，符合測序要求(圖1).將PCR產物送測序公司測序，檢測第二外顯子、第六外顯子、第七外顯子區(qū)域SNP如表3所示.在所發(fā)現(xiàn)的9個SNPs中除SNP1、SNP3、SNP8和SNP9為錯義突變外，其余均為同義突變.SNP1導致其編碼的第12位氨基酸發(fā)生改變，命名為V12I錯義突變，且該突變位于FMO3蛋白結構的FAD結合區(qū).SNP3導致其編碼的第252位氨基酸發(fā)生改變，命名為S252N錯義突變.SNP8導致其編碼的第335位氨基酸發(fā)生改變，命名為Y335H錯義突變.SNP9導致其編碼的第336位氨基酸發(fā)生改變，命名為S336P錯義突變.且Y335H和S336P連鎖.

由于在突變純合子中一共有4只試驗動物出現(xiàn)S252N突變，且在雌性個體中只有一個出現(xiàn)，所以暫未對其進行分析.經過對鴨雄性和雌性群體V12I、Y335H、S336P突變基因型進行卡方適合性檢測，發(fā)現(xiàn)2個群體處于遺傳平衡狀態(tài)(P>0.05).從表4中我們可以看到，V12I突變位點A突變基因的基因頻率在雄性和雌性群體中分別為0.65和0.56，均高于同群體中等位基因G的基因頻率，2個群體在V12I突變位點的基因頻率并不一致.因為Y335和S336P 2個位點連鎖，所以Y335H和S336P突變基因型卡方適應性檢測結果相同(表5)，Y335H和S336P突變位點C突變基因的基因頻率在雄性和雌性群體中分別為0.325和0.24，均低于同群體中等位基因T的基因頻率，2個群體在Y335H和S336P突變位點的基因頻率不一致.

圖1 PCR產物瓊脂糖凝膠電泳Figure 1 Agarose gel electrophoresis of PCR products

表3 鴨FMO3基因外顯子二、外顯子六和外顯子SNPs檢測

表4 V12T突變G/A基因型頻率和基因頻率

表5 Y335H和S336P突變T/C基因型頻率和基因頻率

2.2 鴨FMO3 mRNA在肝臟和腎臟中的相對定量分析

本試驗以V12I突變位點的基因型，來探究基因型、是否添加10%動物油脂及其交互作用對肝臟、腎臟FMO3mRNA表達水平的影響(表6).基因型間肝臟FMO3mRNA表達量無顯著性差異(P=0.181 ) ，AA基因型高于AG和GG基因型.肝臟FMO3mRNA表達水平受動物油脂添加的影響，在添加10%的動物油脂之后，肝臟FMO3mRNA的表達水平較不添加動物油脂的處理組顯著降低17%(P<0.05).單因素方差分析結果表明，飼料中添加10%的動物油脂，降低了AA基因型(18%)和AG基因型(2.7%)肝臟FMO3mRNA的表達水平，但差異不顯著；顯著降低了(28%)GG基因型肝臟FMO3mRNA的表達水平(P<0.05).是否添加10%的動物油脂和基因型對肝臟FMO3mRNA的表達無明顯交互作用.腎臟FMO3mRNA的表達沒有顯著性差異，是否添加10%的動物油脂、基因型以及二者的交互作用對腎臟FMO3mRNA的表達沒有顯著性影響.

表6 FMO3基因型和動物油脂對鴨肝臟、腎臟FMO3 mRNA表達量的影響

3 討論

Lawton等[19]推測FMO3蛋白結構包含N終端FAD結合域、NAD(P)H結合區(qū)域、一個中央區(qū)域和C端接口域.另外，F(xiàn)MO3還包含有FMO特征基序和FATGY基序，其中FATGY基序被認為參與底物識別，是酶與底物的結合區(qū)域的關鍵基序[20].FMO3基因多態(tài)性可以影響到很多外源物質的代謝，因FMO3功能降低或喪失會使TMA不能正常代謝排出體外，當過多的三甲胺排出時會使機體產生明顯的魚腥味.這種疾病被稱為原發(fā)性三甲胺尿(TMAU)，這是一種常染色體隱性遺傳疾病[1,21].本研究結果表明鴨FMO3基因第二、六、七外顯子區(qū)域的9個SNPs中有4處為錯義突變，這一結果和Wang等[18]一樣，.對這些錯義突變基因型進行卡方適應性檢測，發(fā)現(xiàn)2個群體處于遺傳平衡狀態(tài)(P>0.05).在這些錯義突變中，SNP1導致其編碼的第12位氨基酸發(fā)生改變，命名為V12I錯義突變，且該突變位于FMO3蛋白結構的FAD結合區(qū)，在FATGY基序沒發(fā)現(xiàn)錯義突變，這和Honkatukia等[13]在雞上的研究結果不同，可能由于鴨的FMO3基因比雞的更保守.由以上結果可以看出V12I錯義突變可能與FMO3基因功能有關.然后，本研究對V12I錯義突變個體的肝、腎FMO3基因的表達進行測定分析發(fā)現(xiàn)GG突變純合子個體在飼喂添加10%動物油脂時，肝臟中FMO3基因的表達量顯著低于飼喂不含動物油脂的處理組(P<0.05)，AA、AG 2種基因型在是否飼喂含10%的動物油脂2個處理組中肝臟FMO3基因的表達量均沒有顯著性差異(P>0.05).而是否添加10%的動物油脂、基因型以及二者的交互作用對腎臟FMO3基因的表達沒有顯著性影響(P>0.05)，這一結果和王晶等[7]在雞上對于T239S位點在肝、腎中表達的研究結果相似.

本研究表明，飼料中添加動物油脂可抑制有V12I錯義突變的鴨FMO3基因在肝臟中的表達，且對GG基因型的影響顯著，飼料中添加動物油脂和基因型與鴨FMO3基因在肝臟中的表達調控有關，可為鴨FMO3基因的表達調控研究以及飼糧配方設計提供理論依據.