趙祜，呂東，劉賢德，張宏斌，趙明，趙興鵬，陳剛

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省祁連山水源涵養(yǎng)林研究院，甘肅 張掖 734000)

青海云杉(Piceacrassifolia) 為西北地區(qū)用材林、水源涵養(yǎng)林和城鄉(xiāng)綠化觀賞的優(yōu)良樹種，主要分布于我國青海、甘肅、寧夏、內(nèi)蒙古等省(區(qū))，其抗寒、抗旱、抗病蟲.張掖市龍渠青海云杉種子園1984年部省聯(lián)建，建園材料來源于西水、連城、東大山、大黃山等11個(gè)自然分布區(qū)，共收集260個(gè)青海云杉優(yōu)良家系.40多年來，青海云杉種子園在區(qū)域的良種造林以及城市道路綠化中發(fā)揮了重要作用.目前，張掖市龍渠青海云杉無性系種子園中開展了半同胞子代測定以及優(yōu)良家系選擇[1]、無性系開花特性及種子園花粉流時(shí)空變化[2]、無性系雌雄球花及球果量變異研究[3]、無性系物候期對氣象因子的響應(yīng)研究[4]、半同胞子代苗期生長性狀遺傳分析[5]、無性系種子園開花習(xí)性、[6]、優(yōu)良單株半同胞種子及其子代苗表型性狀分析[7]等方面的研究.國內(nèi)學(xué)者利用ISSR分子標(biāo)記對10個(gè)青海云杉天然群體進(jìn)行了遺傳分析[8]，國外利用AFLP、SSR、EST-SSR等分子標(biāo)記技術(shù)對云杉屬樹種進(jìn)行了研究[9-20].目前，利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)尚未對張掖市龍渠青海云杉種子園無性系進(jìn)行遺傳多樣性研究，無性系間親緣關(guān)系還未有準(zhǔn)確結(jié)論.本研究基于SSR分子標(biāo)記技術(shù)，以青海云杉無性系種子園109個(gè)無性系為研究對象，分析青海云杉無性系遺傳多樣性和親緣關(guān)系，以期為青海云杉高世代種子園的建立提供可靠的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

從張掖市龍渠青海云杉種子園109個(gè)無性系單株上采集當(dāng)年生嫩葉，清水清洗干凈用硅膠干燥處理后帶回實(shí)驗(yàn)室置于-80℃冰箱中保存.供試材料109個(gè)青海云杉無性系種源地如表1所示.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取 將處理好的青海云杉針葉剪成1 cm樣本，運(yùn)用改良CTAB法[21]提取青海云杉基因組DNA，用紫外分光光度計(jì)檢測基因組DNA純度，用核酸分析儀測定基因組DNA濃度，稀釋為濃度為75 ng/μL，純度D為1.8，母液放入冰箱中(-20 ℃)保存待用.

1.2.2 SSR-PCR反應(yīng)體系的建立、優(yōu)化及引物篩選 青海云杉SSR-PCR反應(yīng)體系采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和單因素分析方法建立.采用5因素4水平正交試驗(yàn)方法，A因素Mg2+(25 mmol/L)4個(gè)水平A1～A4,分別為1.5、2.0、2.5、3.0 μL.B因素TaqDNA聚合酶B1～B4，分別為0.6、0.7、0.8、0.9 μL.C因素模板DNA (5～10 ng/μL)4個(gè)水平C1～C4，分別為0.5、 1.0、1.5、2.0 μL；D因素正反向引物4個(gè)水平D1～D4，分別為0.25、0.50、0.75、1.00 μL；E因素dNTP (10 mmol/L) 4個(gè)水平，E1～E4分別為0.35、0.40、0.45、0.50 μL.在其PCR反應(yīng)體系中，首先加入10×PCR緩沖液13.4 μL，最后加入超純水HPLC使PCR反應(yīng)總體積達(dá)到20.0 μL.如表2和表3所示，設(shè)計(jì)試驗(yàn)中所用引物EAC1C08，序列(AC)36，對PCR的16種組合反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，根據(jù)電泳圖譜，選擇適合青海云杉的SSR-PCR反應(yīng)體系.每個(gè)試驗(yàn)處理進(jìn)行3次重復(fù).最終得到青海云杉SSR-PCR最佳的反應(yīng)體系.選用從挪威云杉中開發(fā)出的SSR引物60對進(jìn)行測試[15]，篩選出多態(tài)性好，適用于青海云杉的有效引物.

1.3 數(shù)據(jù)處理

對上述操作得到的圖譜進(jìn)行分析，確定每個(gè)條帶的基因型，依據(jù)分子量命名等位基因.采用POPgene version1.31軟件[22]，計(jì)算出遺傳多樣性的復(fù)合參數(shù)[23-27]，多態(tài)性位點(diǎn)百分率(PPL)、多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)(N)、觀測等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)(ne)、期望雜合度(He)、Shannon′s多態(tài)性信息指數(shù)(I).無性系的遺傳關(guān)系分析，根據(jù)SSR同源性條帶是否存在，用矩陣表示結(jié)果，采用NTSYS-pc2.0軟件[28]，基于Dice相似性系數(shù)構(gòu)建UPGMA聚類圖.

表1 109個(gè)青海云杉供試材料種源地統(tǒng)計(jì)

表2 青海云杉無性系SSR-PCR反應(yīng)體系的正交設(shè)計(jì)因素水平

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR-PCR反應(yīng)體系的建立、優(yōu)化及引物篩選

對影響PCR擴(kuò)增結(jié)果的5個(gè)因素(Mg2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶、模板DNA、引物、退火溫度)進(jìn)行選擇和優(yōu)化，ISSR-PCR反應(yīng)的最佳反應(yīng)體系為19.75 μL，其中DNA (5～10 ng/μL)為1.0 μL，dNTP (10 mmol/L)為0.45 μL，正反向引物 (10 μmol/L)為0.25 μL，Mg2+(25 mmol/L)為2 μL，TaqDNA聚合酶 (5 U/μL)為0.8 μL，10×PCR緩沖液為2 μL、HPLC超純水為13.25 μL.94 ℃預(yù)變性3 min； 94 ℃變性30 s，44個(gè)循環(huán)；50～60 ℃退火30 s(各引物退火溫度不同)；72 ℃延伸1 min；最后72 ℃延伸3 min.從已知合成的引物[29]中進(jìn)行試驗(yàn)，從試驗(yàn)結(jié)果中篩選出10條擴(kuò)增條帶清晰、穩(wěn)定性好的引物(圖1).

表3 5因素4水平青海云杉SSR-PCR反應(yīng)的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.2 青海云杉無性系遺傳多樣性分析

基于已建立和優(yōu)化的青海云杉無性系SSR-PCR反應(yīng)體系，得出青海云杉無性系PCR產(chǎn)物各引物的編號、序列、最適退火溫度Ta、有效等位基因數(shù)ne、觀測雜合度Ho、期望雜合度He、Shannon信息指數(shù)I，如表4所示.

由表3可知，選取的10對引物的多態(tài)性比較高.試驗(yàn)共擴(kuò)增出230個(gè)多態(tài)性條帶，大小集中在100～800 bp之間.10對引物多態(tài)性位點(diǎn)百分率PPL為100.00%；10對引物ne大小順序?yàn)椋篍AC7B09>EAC1A07>EAC1C08>EAC6F04> EAC6C02>EAC6D01> EAC7D10>SPL3AGG2>SPL3AGB4>EAC1F04)，ne為7.948 8～22.118 1；EAC7B09的ne達(dá)到了最高為22.1181；10對引物Ho的大小順序?yàn)镋AC1C08>EAC6D01>EAC7D10>SPL3AGG2>EAC6F04>EAC1A07=EAC1F04=EAC6C02=EAC7B09=SPL3AGB4=0.000 0，Ho變化范圍比較小，為0～0.377 4；EAC1C08的Ho最高，達(dá)到了0.377 4；10對引物He大小為EAC7B09>EAC1C08>EAC6F04>EAC1A07>EAC6C02>EAC6D01>EAC7D10>SPL3AGG2>SPL3AGB4>EAC1F04，10對引物He的變化范圍最小，為0.885 2～0.959 3，EAC7B09的He值最高，為0.959 3；Shannon′s 信息指數(shù)I大小順序?yàn)镋AC7B09>EAC1A07>EAC1C08>EAC6F04>EAC6C02>EAC6D01> EAC7D10>SPL3AGG2>SPL3AGB4>EAC1F04)，10對引物Shannon′s 信息指數(shù)為2.225 7～3.242 4，EAC7B09的I達(dá)到了最高，為3.242 4.

圖1 10對青海云杉SSR引物電泳圖譜(無性系編號1-30號)Figure 1 Electrophoretic patterns for 10 pairs of Picea crassifolia SSR primer selection(clones number 1-30)

表4 青海云杉10對SSR引物篩選及無性系遺傳多樣性參數(shù)

2.3 青海云杉無性系遺傳關(guān)系

運(yùn)用NTSYS軟件進(jìn)行相關(guān)分析，采用Dice相似系數(shù)加權(quán)類平均法(UPGMA)后聚類分析[29-30]，聚類分析結(jié)果如圖2所示.109個(gè)青海云杉無性系得到了有效的區(qū)分，把109個(gè)無性系分成5個(gè)組，Ⅰ和Ⅱ組包含的無性系如圖2所示；Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組包含的無性系如圖3所示.

3 討論

物種和種群的進(jìn)化程度對環(huán)境的適應(yīng)能力取決于它們的遺傳多樣性.本研究采用SSR分子標(biāo)記對張掖市龍渠青海云杉無性系種子園內(nèi)的109個(gè)青海云杉無性系進(jìn)行了遺傳多樣性研究，研究結(jié)果表明，青海云杉無性系具有較高的遺傳多樣性水平，研究結(jié)果與王文峰等[8]ISSRs標(biāo)記對青海云杉10個(gè)天然群體遺傳多樣性研究的結(jié)果類似.造成青海云杉無性系具有較高的遺傳多樣性水平的原因可能有2個(gè)，原因一是因?yàn)楸狙芯恐械那嗪Ｔ粕紵o性系來源于祁連山區(qū)的西營河、西水、連城、哈溪、古城、東大山、大黃山、大河口、寺大隆、隆暢河、馬蹄共11個(gè)自然分布區(qū)，地理來源廣泛；原因二是青海云杉是異交風(fēng)媒樹種，個(gè)體間基因交流廣泛，也會增加該樹種的遺傳多樣性.本研究的青海云杉無性系遺傳多樣性指數(shù)(PPL=100.00%，He=0.921 0，I=2.774 7)，與其他的植物相比較(表5)，均高于生長于陜西的野生毛櫻桃(He=0.672，I=1.280)[31]、生長于福建、貴州等地的杉木(He= 0.500，I=0.980)[32]、生長于陜西、甘肅等地的冷杉(He=0.841，I=2.130)[33]、生長于湖北的杜仲(He=0.379 8，I=0.643 3)[34].本研究結(jié)果將對張掖市龍渠青海云杉無性系種子園無性系合理配置、擴(kuò)大種子園內(nèi)種子的遺傳基礎(chǔ)、提高種子的遺傳品質(zhì)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義.

4 結(jié)論

本研究采用SSR分子標(biāo)記法對109個(gè)青海云杉無性系進(jìn)行研究.通過建立并優(yōu)化青海云杉的SSR-PCR反應(yīng)體系篩選出的10對有效引物，基于SSR分子標(biāo)記技術(shù)對其進(jìn)行了遺傳多樣性研究，結(jié)果顯示，109個(gè)青海云杉無性系遺傳多樣性分析中，共擴(kuò)增出230條多態(tài)性條帶，多態(tài)百分率(PPL)為100.00%，平均有效等位基因數(shù)(ne)為14.76，平均觀測雜合度(Ho)為0.06，平均期望雜合度(He)為0.92，平均Shannon′s多態(tài)性信息指數(shù)(I)為2.77，揭示了青海云杉無性系間的遺傳多樣性較為豐富；對109個(gè)青海云杉無性系采用UPGMA 聚類分析方法后將109個(gè)青海云杉無性系分為5組，聚類分析結(jié)果與種子園建園材料的地理來源廣泛及個(gè)體間基因交流廣泛相吻合.

圖2 109個(gè)青海云杉無性系聚類圖Figure 2 The cluster diagram of 109 clones of Picea crassifolia

圖3 109個(gè)青海云杉無性系聚類圖Figure 3 The cluster diagram of 109 clones of Picea crassifolia

表5 青海云杉與其他物種遺傳多樣性比較