賈金靖 莫秀梅 劉俊峰 王寧 鄭焱 陳達燦

1西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院皮膚科710004；2廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院皮膚科510120

Yes 相關(guān)蛋白（Yes-associated protein，YAP）是Hippo 信號通路的關(guān)鍵組分，其在調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡等方面發(fā)揮重要作用［1-2］。我們的前期研究［3］發(fā)現(xiàn)，銀屑病皮損YAP 陽性率升高，YAP 主要表達于皮損組織基底層和棘層下部，基底層作為表皮的生發(fā)區(qū)，提示YAP 在銀屑病表皮異常增殖中發(fā)揮重要作用。治療銀屑病的方劑中丹參多見［4-5］。體外實驗研究表明，丹參素在多種腫瘤細(xì)胞中均有抑制細(xì)胞增殖、引起細(xì)胞周期阻滯、誘導(dǎo)凋亡以及抑制侵襲和轉(zhuǎn)移等作用［6-10］。用含白細(xì)胞介素1α（IL-1α）、IL-17、IL-22、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、抑癌蛋白M（oncostatin M）的混合物M5刺激人永生化表皮細(xì)胞（HaCaT）后其病理生理學(xué)特征與銀屑病高度類似，既往有很多文獻將其作為銀屑病樣細(xì)胞模型［11-13］。本研究檢測丹參素對M5誘導(dǎo)的銀屑病樣細(xì)胞模型中YAP 的表達情況，探討其對角質(zhì)形成細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期以及凋亡的影響。

資料與方法

一、實驗材料與儀器

HaCaT 細(xì)胞（上海復(fù)祥生物科技有限公司）、DMEM 培養(yǎng)液（美國HyClone 公司）、丹參素（C9H10O5，相對分子質(zhì)量162.14，純度95%，大連美侖生物技術(shù)有限公司）、M5（IL-1a、IL-17、IL-22、TNF-α、Oncostatin M，美國PeproTech 公司）。兔抗人YAP 抗體（美國Cell Signaling 公司）。細(xì)胞周期相關(guān)蛋白抗體：兔抗人細(xì)胞周期蛋白A（Cyclin A）、兔抗人Cyclin B1、鼠抗人Cyclin D1、鼠抗人Cyclin E（美國Santa Cruz公司）。細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白抗體：兔抗人胱天蛋白酶3剪切體（cleaved-caspase-3）、兔抗人p21（沈陽萬類科技有限公司），兔抗人Bcl-2、兔抗人BAX（美國Cell Signaling公司）。鼠抗人p53（美國Santa Cruz 公司）。鼠抗人β 肌動蛋白抗體、HRP 標(biāo)記的羊抗兔二抗、HRP 標(biāo)記的羊抗鼠二抗（美國Santa Cruz公司）。細(xì)胞周期檢測試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）。流式細(xì)胞儀（FACSCalibur，美國BD公司）。

二、銀屑病樣細(xì)胞模型構(gòu)建

HaCaT細(xì)胞由含10%胎牛血清及100 U/L青霉素和100 mg/L 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用M5（含10 μg/L 的IL-1α、IL-17、IL-22、TNF-α、Oncostatin M）作用于細(xì)胞48 h，制作銀屑病樣細(xì)胞模型［11-13］。HaCaT 細(xì)胞加入M5的同時分別加入0（丹參素對照組，以下簡稱對照組）、0.125、0.25、0.5 mmol/L 丹參素刺激細(xì)胞，以未做處理的HaCaT細(xì)胞為空白對照組。

三、實時定量PCR檢測丹參素對銀屑病樣細(xì)胞模型YAP mRNA表達的影響

丹參素刺激細(xì)胞48 h 后，采用Trizol 試劑盒提取各實驗組細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA 后擴增。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，YAP引物序列：正向5′-GCTAGACCCAAGGCTT GACC-3′，反向5′-ATTTGCTGTGCTGGGATTGA-3′；GAPDH 引物序列：正向5′-CACTGTGCCCATCTAC GAGG-3′，反向5′-TAATGTCACGCACGATTTCC-3′。PCR 擴增條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，共40 個循環(huán)，獲取各組標(biāo)本的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算機分析Ct值，采用2-ΔΔCt法計算YAP mRNA的相對表達。

四、Western 印跡檢測丹參素對銀屑病樣細(xì)胞模型YAP及相關(guān)蛋白水平的影響

丹參素刺激細(xì)胞48 h后，提取各組細(xì)胞總蛋白并進行蛋白定量，取25 μg 蛋白行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉非特異性抗原，加入特異性一抗，4 ℃孵育過夜，洗膜后加入二抗室溫孵育1 h，曝光、顯影、定影，掃描后用Image J 軟件分析目標(biāo)條帶灰度值，計算蛋白的相對表達量。

五、細(xì)胞增殖實驗

采用噻唑藍(lán)（MTT）比色法檢測細(xì)胞的增殖能力。取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于96 孔板，每孔5 ×103個細(xì)胞加200 μl培養(yǎng)液，培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入MTT 20 μl，避光孵育4 h，棄上清液，每孔加入二甲基亞砜150 μl，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，采用酶標(biāo)儀490 nm 波長測定各孔吸光度（A 值）間接反映活細(xì)胞數(shù)量。每組設(shè)5個復(fù)孔。

六、細(xì)胞周期檢測

按照細(xì)胞周期試劑盒說明書操作，常規(guī)消化各組細(xì)胞，PBS 洗滌2 次，于-20 ℃、75%乙醇溶液中固定過夜，再次用PBS 洗滌2 次，加入終濃度為100 μg/ml的RNaseA和50 μg/ml的PI染色液，37 ℃避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞周期，激發(fā)波長488 nm，采用Modifit 軟件分析檢測結(jié)果。Western印跡檢測丹參素刺激48 h后各組細(xì)胞細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的相對表達。

七、細(xì)胞凋亡檢測

按照細(xì)胞凋亡試劑盒說明書操作，常規(guī)消化各組細(xì)胞，PBS 洗滌2 次，2 000 轉(zhuǎn)/min（離心半徑9.7 cm）離心5 min，收集1×105～5×105個細(xì)胞，加入500 μl 的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μl Annexin V-FITC 混勻后再加入5μl PI 染色液混勻，室溫避光孵育5 ～15 min，流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的凋亡情況。Western印跡檢測丹參素刺激48 h后各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的相對表達。

八、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、YAP在銀屑病樣細(xì)胞模型中的表達

實時定量PCR 與Western 印跡結(jié)果顯示，銀屑病樣細(xì)胞模型組YAP mRNA、蛋白相對表達（2.03 ± 0.04、2.20 ± 0.02）均高于HaCaT 細(xì)胞組（0.95 ± 0.03、1.01 ± 0.02，t = 21.93、44.38，均P ＜0.001）。見圖1。

二、丹參素對銀屑病樣細(xì)胞模型YAP 表達的影響

實時定量PCR 與Western 印跡結(jié)果顯示，空白對照組與0（對照組）、0.125、0.25、0.5 mmol/L 丹參素組YAP mRNA、蛋白的相對表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F = 93.96、56.65，P ＜0.001），對照組YAP mRNA、蛋白的相對表達水平均高于空白對照組（P ＜0.001），亦高于0.125、0.25、0.5 mmol/L 丹參素組（均P ＜0.05），YAP mRNA 及蛋白表達水平隨丹參素濃度的增加呈降低趨勢。見圖2。

三、丹參素對銀屑病樣細(xì)胞模型增殖能力的影響

空白對照組、對照組與0.125、0.25、0.5 mmol/L丹參素組細(xì)胞分別在培養(yǎng)24、48、72 h 時的增殖活力差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=43.17、71.65、88.39，均P ＜0.001），在培養(yǎng)24 h時，對照組細(xì)胞增殖活力高于0.5 mmol/L 丹參素組細(xì)胞（P ＜0.001）；培養(yǎng)48、72 h 時，對照組細(xì)胞增殖活力均高于0.125、0.25、0.5 mmol/L 丹參素組（均P ＜0.05），且隨著丹參素濃度的增加增殖能力呈降低趨勢。見圖3。

圖1 Western 印跡檢測YAP 在銀屑病樣細(xì)胞模型中的表達銀屑病樣細(xì)胞組YAP蛋白的表達高于HaCaT細(xì)胞組

圖2 實時定量PCR（2A）與Western 印跡（2B）檢測丹參素對銀屑病樣細(xì)胞模型YAP 表達的影響 丹參素可抑制銀屑病樣細(xì)胞模型中YAP mRNA、蛋白的相對表達。1：空白對照組；2 ～5：分別為0（對照組）、0.125、0.25、0.5 mmol/L丹參素組。a：與對照組相比，P ＜0.01

圖3 MTT 法檢測丹參素處理銀屑病樣細(xì)胞模型24、48、72 h對細(xì)胞增殖的影響 丹參素可抑制銀屑病樣細(xì)胞模型的增殖。a：與對照組相比，P ＜0.01

四、丹參素對銀屑病樣細(xì)胞模型細(xì)胞周期的影響

空白對照組、0（對照組）、0.125、0.25、0.5 mmol/L丹參素組G0/G1 期、S 期、G2/M 期細(xì)胞比例差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F = 61.55、313.60、9.20，均P ＜0.01）。0（對照組）、0.125、0.25、0.5 mmol/L 丹參素組進一步兩兩比較，除對照組與0.125 mmol/L 丹參素組、0.25 與0.5 mmol/L 丹參素組間G0/G1 期細(xì)胞比 例，0.125 與0.25 mmol/L 丹參素 組、0.25 與0.5 mmol/L 丹參素組間G2/M 期細(xì)胞比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＞0.05），余各組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＜0.05）。0.125、0.25、0.5 mmol/L丹參素組G2/M 期細(xì)胞比例高于對照組，S 期細(xì)胞比例低于對照組；0.25、0.5 mmol/L 丹參素組G0/G1期細(xì)胞比例高于對照組。見圖4。

Western印跡結(jié)果顯示，空白對照組、對照組與0.125、0.25、0.5 mmol/L 丹參素組Cyclin A、Cyclin B1、Cyclin D1、Cyclin E 蛋白相對表達水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F = 206.50、92.89、280.36、48.45，P ＜0.001）。對照組、0.125、0.25、0.5 mmol/L 丹參素組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＜0.05），對照組相對表達水平均高于0.125、0.25、0.5 mmol/L丹參素組。見圖5。

五、丹參素對銀屑病樣細(xì)胞模型凋亡的影響

空白對照組、對照組與0.125、0.25、0.5 mmol/L丹參素組的凋亡率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=154.08，P ＜0.001），對照組、0.125、0.25、0.5 mmol/L 丹參素組間兩兩比較，除對照組與0.125 mmol/L 丹參素組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05），余各組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＜0.05）。對照組凋亡率低于0.25、0.5 mmol/L丹參素組。見圖4。

Western印跡結(jié)果顯示，空白對照組、對照組與0.125、0.25、0.5 mmol/L 丹 參 素 組 細(xì) 胞cleavedcaspase-3、Bcl-2、BAX、p53、p21 的相對表達水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=15.42、19.36、33.98、17.11、26.81，P ＜0.001），0.5 mmol/L 丹參素組cleavedcaspase-3 水平高于對照組、0.125 mmol/L 丹參素組（均P ＜0.05），對照組、0.125 與0.25 mmol/L 丹參素組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＞0.05）；0.5 mmol/L 丹參素組Bcl-2 水平低于對照組、0.125 mmol/L丹參素組（均P ＜0.05），對照組、0.125與0.25 mmol/L 丹參素組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＞0.05）；0.5 mmol/L 丹參素組BAX 水平高于0.25 mmol/L 丹參素組，0.25 mmol/L 丹參素組高于0.125 mmol/L 丹參素組及對照組（均P ＜0.05），對照組與0.125 mmol/L丹參素組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）；0.5 mmol/L丹參素組p53水平高于對照組、0.125 mmol/L 丹參素組（均P ＜0.05），0.125 與0.25 mmol/L 丹參素組、0.25 與0.5 mmol/L丹參素組甲差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＞0.05）；0.5 mmol/L 丹參素組p21 水平高于0.25 mmol/L 丹參素組，0.125 mmol/L 丹參素組高于對照組（均P ＜0.05），0.125與0.25 mmol/L丹參素組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。見圖5。

圖4 流式細(xì)胞儀檢測丹參素對銀屑病樣細(xì)胞模型細(xì)胞周期及凋亡的影響 4A、4C：丹參素處理組S期細(xì)胞比例降低，G0/G1期、G2/M期細(xì)胞比例升高；4B、4D：丹參素可促進細(xì)胞凋亡。1：空白對照組；2 ～5：分別為0（對照組）、0.125、0.25、0.5 mmol/L 丹參素組。a：與對照組相比，P ＜0.05

圖5 Western印跡檢測丹參素刺激48 h后各組細(xì)胞周期相關(guān)蛋白、凋亡相關(guān)蛋白的表達 對照組Cyclin A、Cyclin B1、Cyclin D1、Cyclin E蛋白相對表達水平高于0.125、0.25、0.5 mmol/L 丹參素組；對照組cleaved-caspase-3 相對水平低于0.5 mmol/L 丹參素組，BAX 水平低于0.25、0.5 mmol/L丹參素組，p53、p21水平低于0.125、0.25、0.5 mmol/L丹參素組，Bcl-2水平均高于0.5 mmol/L丹參素組。1：空白對照組；2 ～5：分別為0（對照組）、0.125、0.25、0.5 mmol/L丹參素組。a：與對照組相比，P ＜0.05

討 論

近來研究發(fā)現(xiàn)，YAP在多種惡性腫瘤中表達上調(diào)，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［14］。D′Addario 等［15］發(fā)現(xiàn)，在正常人原代角質(zhì)形成細(xì)胞中過表達YAP 后，可使原代角質(zhì)形成細(xì)胞永生化增殖，阻礙其正常分化進程。以往研究發(fā)現(xiàn)，YAP 可通過下游RASAKT/ERK 通路促進皮膚鱗狀細(xì)胞癌的進展［16］，我們既往的研究證實，YAP在銀屑病皮損組織中表達增加［3］，提示YAP可能作為銀屑病發(fā)病機制中的關(guān)鍵分子，如能通過外界手段干預(yù)其表達，將有望發(fā)揮治療銀屑病的作用。丹參是治療銀屑病的常用中藥之一，體外實驗發(fā)現(xiàn)，在胃癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、黑素瘤等多種腫瘤細(xì)胞中，丹參素均有抑制細(xì)胞增殖、引起細(xì)胞周期阻滯、誘導(dǎo)凋亡以及抑制侵襲和轉(zhuǎn)移等作用，上述作用可能與其較強的自由基清除和抗氧化活性、抑制AKT 以及ERK1/2 的磷酸化水平有關(guān)［6-10］，這些機制及通路與我們前期研究中YAP 在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中發(fā)揮作用的相關(guān)信號通路一致［16］。

本研究結(jié)果表明，丹參素可以抑制銀屑病樣細(xì)胞模型中YAP mRNA 及蛋白的表達，同時也可以抑制細(xì)胞增殖、引起細(xì)胞周期阻滯在G0/G1 期，并且不同程度地抑制細(xì)胞周期蛋白Cyclin A、Cyclin B1、Cyclin D1 及Cyclin E 的表達，而這些蛋白的表達可通過影響細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)換進而影響細(xì)胞的增殖［17］。因此，我們推測，丹參素可能正是通過影響這些細(xì)胞周期蛋白的表達發(fā)揮抑制銀屑病細(xì)胞增殖的作用，引起細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白中，Caspase-3 是多種凋亡途徑的下游效應(yīng)部分，被認(rèn)為是調(diào)控凋亡的執(zhí)行蛋白酶，其激活（即被剪切為cleaved-caspase-3）代表細(xì)胞凋亡機制進入了不可逆轉(zhuǎn)的階段［18］；Bcl-2 和BAX 同屬于Bcl-2 家族，二者在調(diào)亡調(diào)控過程中功能是相互對抗的，Bcl-2 表達高于BAX 時，抑制細(xì)胞凋亡，反之則促進細(xì)胞凋亡［19］。P53 基因是人體內(nèi)的抑癌基因，有促凋亡的作用，而p21 是其下游調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵靶基因［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，丹參素可誘導(dǎo)銀屑病樣細(xì)胞的凋亡，并同時增加促凋亡蛋白cleaved-caspase-3、BAX、p53、p21的表達，抑制Bcl-2的表達，提示丹參素可能是通過影響這些凋亡相關(guān)蛋白的表達促進銀屑病樣細(xì)胞的凋亡。既往研究證實［3］，在HaCaT細(xì)胞中敲除YAP后可抑制細(xì)胞的增殖，促進凋亡，將細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，本文中丹參素對銀屑病樣細(xì)胞的作用與上述HaCaT 細(xì)胞中敲除YAP 后細(xì)胞的表現(xiàn)高度吻合，且引起細(xì)胞周期相關(guān)蛋白及凋亡相關(guān)蛋白的表達改變趨勢也基本一致。同時，本研究也發(fā)現(xiàn)，丹參素可呈劑量依賴性地降低YAP 的表達水平，因此推測丹參素通過影響YAP 的表達，進而抑制了銀屑病表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的異常增殖而發(fā)揮治療作用。

綜上，本研究結(jié)果提示，丹參素可能通過抑制銀屑病樣細(xì)胞中YAP 的表達，進而發(fā)揮細(xì)胞周期阻滯、抑制細(xì)胞增殖、促進細(xì)胞凋亡的作用。本研究尚處在初步探索階段，具體的信號通路機制等仍有待后續(xù)研究進一步完善。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突