肖學(xué)敏 何艷艷 徐浩翔 王寶璽 林立航

1福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院皮膚科，福州350001；2中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病醫(yī)院，南京210042；3中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 整形外科研究所皮膚科，北京100144

反常性痤瘡（acne inversa，AI；OMIM 142690），又稱化膿性汗腺炎，是一種好發(fā)于皺褶部位的慢性復(fù)發(fā)性炎癥性皮膚病。2010 年，王寶璽等［1］首先發(fā)現(xiàn)編碼γ 分泌酶（γ-secretase，GS）不同亞單位的基因突變可引起部分家族性AI 的發(fā)生。γ分泌酶包含4 個(gè)必要組分，分別為早老素1（presenilin-1，PSEN1）、nicastrin 蛋白（NCSTN）、前咽缺陷蛋白（anterior pharynx defective-1，APH1）和早老素增強(qiáng)子2（presenilin enhancer-2，PEN2）。目前已在AI患者的γ分泌酶基因上發(fā)現(xiàn)41個(gè)不同的突變位點(diǎn)，其中NCSTN 基因突變27 個(gè)，均為功能缺失性突變［2-3］。NCSTN 亞基屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白，參與γ分泌酶的組裝、成熟及穩(wěn)定，此外還具有募集γ 分泌酶底物的功能，其表達(dá)異?？蓪?dǎo)致γ分泌酶活性和功能受損［4］。目前認(rèn)為毛囊栓塞為AI 的初始及最主要致病因素，NCSTN 基因功能缺失性突變導(dǎo)致γ分泌酶-Notch信號(hào)通路表達(dá)及活性受損，進(jìn)而影響角質(zhì)形成細(xì)胞正常增殖和分化，可能在AI 的發(fā)病中發(fā)揮重要作用［5］。然而近期的研究顯示，某些NCSTN 基因的功能缺失性突變并不影響Notch信號(hào)通路的正?；罨?，說明可能還有其他增殖和分化相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)通路參與AI 發(fā)?。?］。我們通過沉默人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT中NCSTN基因的表達(dá)，研究其下游細(xì)胞增殖及分化相關(guān)信號(hào)通路的改變。

材料和方法

一、材料

1.主要試劑和儀器：人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT 細(xì)胞源自美國ATCC 細(xì)胞庫。胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基、0.25%胰酶（美國GIBCO 公司）；Trizol 核酸抽提試劑、Opti-MEM?I 減血清培養(yǎng)基、Lipofectamine?2000 轉(zhuǎn)染試劑（美國Invitrogen 公司）；DNA 分子標(biāo)志物、5 × DNA Loading Buffer、PrimeScript?RT-PCR試劑盒、TaqTMRT-PCR試劑盒（日本TaKaRa 公司）；UltraPowerTM核酸染料（北京BioTeke 公司），EvaGreen 染料（美國Biotium 公司）；RIPA裂解液、cocktail蛋白酶抑制劑、BCA蛋白濃度測定試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠配制試劑盒（南京碧云天公司）；綿羊抗人NCSTN 多克隆抗體（美國R＆D 公司）；鼠抗綿羊β肌動(dòng)蛋白單克隆抗體（美國Santa Cruz 公司）。CO2培養(yǎng)箱、低溫高速離心機(jī)（美國Thermo 公司），GeneAmp System 9700 PCR 儀、ABI 7300 Real Time PCR儀（美國Applied Biosystems公司）。

2. 引 物 及siRNA：NCSTN - siRNA 由 美 國Invitrogen 公司合成，序列如下：正義鏈5′-UGUUAUGGAAGGCACCAGAGUGGUC-3′，反義鏈3′-GACCACUCUCUGGUGCCUUCCAUAACA-5′；另由Invitrogen 公司合成一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的錯(cuò)配siRNA（mismatch-siRNA control，m-siRNA）作為陰性對照。實(shí)時(shí)定量PCR 引物利用Primer5.0 程序設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，序列見表1。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組：將HaCaT 細(xì)胞以1×106/ml 接種于25 ml 培養(yǎng)瓶中，放入37 ℃、5% CO2飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清以及青霉素（100 U/ml）和鏈霉素（100 mg/L）的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1天，按每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種在6孔板板孔上，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到30%～40%時(shí)，將HaCaT 細(xì)胞分為3 組，干擾組轉(zhuǎn)染100 pmol 特異性NCSTN-siRNA，陰性對照組轉(zhuǎn)染等量m-siRNA，空白對照組僅加等量轉(zhuǎn)染試劑，根據(jù)Lipofectamine?2000 說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后72 h收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.表達(dá)譜芯片檢測干擾組和陰性對照組全基因組mRNA的差異表達(dá)：所用芯片為上?？党缮锕こ逃邢薰咎峁┑腁gilent 人類全基因組表達(dá)譜芯片（4×44K）。干擾組和陰性對照組每組進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，共6 張芯片。用Trizol 試劑分別提取兩組細(xì)胞的總RNA，用NanoDrop ND-1000 定量并經(jīng)變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整度。RNA質(zhì)檢合格后，將總RNA 反轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA，再進(jìn)一步合成用花青素-3-三磷酸胞苷（Cy3）標(biāo)記的cRNA。將標(biāo)記好的cRNA 和芯片雜交，洗脫后利用Agilent Scanner G2505C 掃描得到原始圖像。采用Feature Extraction 軟件（version11.0.1.1）處理原始圖像提取原始數(shù)據(jù)，再使用GeneSpring GX 軟件（version11.5.1）進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化及后續(xù)處理。將讀取的數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理后篩選出差異表達(dá)基因，并對差異表達(dá)基因進(jìn)行基因表達(dá)譜本體（GO）分析。

3.實(shí)時(shí)PCR 驗(yàn)證差異表達(dá)基因mRNA 表達(dá)的改變：利用與芯片同一批組織樣提取RNA 進(jìn)行熒光定量PCR 驗(yàn)證，選取芯片結(jié)果顯示差異表達(dá)的6條基因即NCSTN、Sprouty相關(guān)蛋白2(SPRED2)、表皮生長因子7（FGF7）、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白5（IGFBP5）、人Rho 關(guān)聯(lián)含卷曲螺旋蛋白激酶2（ROCK2）和骨形成發(fā)生蛋白6（BMP6）基因，以人β肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參基因驗(yàn)證芯片結(jié)果的可靠性。將樣本RNA按PrimeScript?RT-PCR試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再根據(jù)TaqTMRT-PCR 試劑盒說明書進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系包括12 μl預(yù)配混合液、正反向引物各1 μl、Taq 酶1 μl、EvaGreen 2.5 μl、cDNA 2.5 μl，加入無核酶水補(bǔ)足至50 μl。將PCR 反應(yīng)體系置于ABI 7300 Real Time PCR 儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。采用2-△△Ct法對實(shí)時(shí)PCR結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，△Ct值表示循環(huán)數(shù)，△△Ct目的基因=△Ct目的基因-△Ctβ肌動(dòng)蛋白，目的基因的相對表達(dá)量=2-△△Ct。另行瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物的單一性。

4. Western 印跡法檢測細(xì)胞NCSTN 蛋白表達(dá)的改變：收集干擾組、陰性對照組及空白對照組HaCaT 細(xì)胞，冷磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞2 次，加適量預(yù)冷的細(xì)胞裂解液，4 ℃裂解細(xì)胞后收集總蛋白。BCA 試劑盒測定蛋白濃度后取適量變性的蛋白樣品，用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，90 V電泳20 min，再于130 V電泳50 min后轉(zhuǎn)膜至聚偏二氯乙烯膜上，用含5%牛血清白蛋白的三羥甲基氨基甲烷吐溫緩沖液浸泡聚偏二氯乙烯膜，室溫?fù)u床封閉2 h。將封閉過的膜加入一抗綿羊抗人NCSTN多克隆抗體（1∶200稀釋）4 ℃孵育過夜，用二抗鼠抗綿羊β肌動(dòng)蛋白單克隆抗體（1∶200稀釋）孵育2 h 后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影。以β 肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參。用Gel-Pro analyzer 軟件分析各條帶灰度值，用每組細(xì)胞各自的β 肌動(dòng)蛋白作歸一化處理，再將空白對照組作為1，其余以比值表示，代表相對表達(dá)量。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物序列

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以±s 表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD法。P ＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、轉(zhuǎn)染特異性NCSTN-siRNA 后HaCaT 細(xì)胞NCSTN mRNA及蛋白表達(dá)情況

瓊脂糖凝膠電泳顯示，轉(zhuǎn)染NCSTN-siRNA 后HaCaT 細(xì)胞NCSTN 基因PCR 擴(kuò)增片段與所設(shè)計(jì)大小一致，且較陰性對照組及空白對照組表達(dá)水平明顯下降（圖1A）。實(shí)時(shí)PCR 顯示，干擾組NCSTN mRNA 的相對表達(dá)量為0.287±0.090，陰性對照組0.969 ± 0.127，空白對照組1.000 ± 0.151，3 組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F =30.787，P=0.001），且干擾組與陰性對照組及空白對照組相比差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 值分別為0.001、0.000）。3 組細(xì)胞均表達(dá)NCSTN（圖1B），干擾組NCSTN 蛋白相對表達(dá)量為0.443±0.085，陰性對照組為1.047±0.114，空白對照組為1.000 ± 0.111，3 組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=31.139，P=0.001），且干擾組與陰性對照組及空白對照組相比差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.000、0.001）。上述結(jié)果提示NCSTN-siRNA 在mRNA及蛋白水平干擾效率良好，可以單獨(dú)用于后續(xù)試驗(yàn)。

二、RNA質(zhì)控分析

圖1 nicastrin（NCSTN）-siRNA 轉(zhuǎn)染后干擾效率驗(yàn)證 1A：實(shí)時(shí)PCR 檢測各組HaCaT細(xì)胞NCSTN mRNA表達(dá)；1B：Western印跡檢測各組HaCaT細(xì)胞NCSTN蛋白表達(dá)

分光光度計(jì)顯示，干擾組與陰性對照組6份樣本A260/A280 值均十分接近2.0，A260/A230 值均大于1.8，說明RNA純度高，達(dá)到試驗(yàn)的要求。RNA樣品瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，28SrRNA、18SrRNA條帶清晰，5SrRNA條帶模糊，表明RNA完整性和純度較好。RNA濃度為861.05 ～1 247.71 mg/L，每管樣本共20 μl，樣本量充足。

三、差異表達(dá)基因、分層聚類圖分析

篩選差異表達(dá)基因的標(biāo)準(zhǔn)為上調(diào)或者下調(diào)倍數(shù)值≥2.0 且P ≤0.05。芯片結(jié)果顯示，干擾組NCSTN 基因mRNA 表達(dá)水平只有陰性對照組的25%左右，說明干擾效率良好。與陰性對照組相比，干擾組表達(dá)下調(diào)基因605 個(gè)，上調(diào)基因444 個(gè)?；趦山M細(xì)胞差異表達(dá)基因得到的分層聚類分析圖顯示，兩組間有明顯的表達(dá)譜差異，而組內(nèi)無明顯差異，證明樣本的重復(fù)性較好（圖2）。

四、GO分析

運(yùn)用Agilent GeneSpring GX software 對表達(dá)譜芯片干擾組與陰性對照組的差異基因進(jìn)行GO 分析。GO 分析包括生物學(xué)過程、細(xì)胞成分及分子功能3部分。富集歸類圖顯示，干擾組與陰性對照組之間的差異表達(dá)分子在上皮發(fā)育、上皮細(xì)胞分化、角質(zhì)形成細(xì)胞分化、角化4種生物學(xué)過程富集程度排在第1、2、4、5位，角質(zhì)化包膜、胞外段部分、蛋白胞外基質(zhì)、胞外段、錨定質(zhì)膜胞外側(cè)5 種細(xì)胞成分富集程度排在第1、3、7、8、10位。見圖3。

五、實(shí)時(shí)PCR驗(yàn)證全基因組表達(dá)譜芯片結(jié)果

驗(yàn)證結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，干擾組SPRED2、ROCK2 和BMP6 基因表達(dá)下調(diào)，F(xiàn)GF7 和IGFBP5 基因表達(dá)上調(diào)，和芯片分析結(jié)果中差異表達(dá)趨勢一致（P ＜0.01），見圖4。

討 論

由于毛囊上皮細(xì)胞的增殖和分化異常是AI的發(fā)病基礎(chǔ)，我們在芯片的海量信息中主要關(guān)注上皮細(xì)胞增生分化及相關(guān)信號(hào)通路的分子表達(dá)情況。生物學(xué)過程富集歸類圖顯示，干擾NCSTN 基因表達(dá)后對上皮發(fā)育、上皮細(xì)胞分化、角質(zhì)形成細(xì)胞分化、角化4 種生物學(xué)過程影響最為顯著。提示NCSTN 基因在維持角質(zhì)形成細(xì)胞正常增殖及分化等自穩(wěn)性的生理過程中發(fā)揮作用，干擾NCSTN 基因的表達(dá)可能導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞增殖過度及異常分化。細(xì)胞成分富集歸類圖顯示，干擾NCSTN 基因表達(dá)影響細(xì)胞的角質(zhì)化包膜及胞外段。角質(zhì)化包膜由多種谷氨酰轉(zhuǎn)移酶共價(jià)連接的蛋白組成，發(fā)揮皮膚屏障的作用，代表角質(zhì)形成細(xì)胞的終末分化；角質(zhì)化包膜的改變也說明沉默NCSTN 基因的表達(dá)可干擾角質(zhì)形成細(xì)胞的正常分化。而胞外段是NCSTN 基因識(shí)別及結(jié)合底物的部位，胞外段的改變說明干擾NCSTN基因的表達(dá)可損害其識(shí)別及結(jié)合底物的功能，從而可能影響γ分泌酶復(fù)合體的酶解活性。我們篩選出5 條有重要意義的差異表達(dá)的細(xì)胞增殖分化相關(guān)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果與芯片檢測結(jié)果趨勢一致，顯示芯片結(jié)果可信。

圖2 干擾組和陰性對照組HaCaT 細(xì)胞差異表達(dá)基因聚類圖分析 橫坐標(biāo)表示樣本，縱坐標(biāo)表示差異基因，紅色代表顯著上調(diào)，綠色代表顯著下調(diào)；C1 ～C3代表3個(gè)陰性對照組樣本，N1 ～N3代表3個(gè)干擾組樣本

圖3 NCSTN基因沉默的HaCaT細(xì)胞前10位富集程度最高的生物學(xué)過程（3A）及細(xì)胞成分（3B） 可見角質(zhì)形成細(xì)胞增生分化相關(guān)的生物學(xué)過程及細(xì)胞成分差異基因富集程度最高

圖4 實(shí)時(shí)PCR 驗(yàn)證表達(dá)譜芯片檢測出的5 條差異表達(dá)基因各基因在干擾組和陰性對照組樣本間的表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）

Ras-MAPK-ERK 通路在調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖與分化中發(fā)揮重要作用，其異常活化可導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞的過度增殖和異常分化［7］。我們發(fā)現(xiàn)Ras-ERK 通路的靶基因SPRED2 的改變，SPRED2同時(shí)也是負(fù)性調(diào)節(jié)因子。作為Sprouty（SPRY）蛋白家族的成員，SPRED2可通過抑制Ras的激活，拮抗血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子及FGF 相關(guān)信號(hào)通路的生物學(xué)作用［8］。其中，F(xiàn)GF7 不但能明顯刺激表皮角質(zhì)形成細(xì)胞生長，還能促進(jìn)毛囊和皮脂腺的角質(zhì)形成細(xì)胞生長，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子［9］。FGFR2b與FGF7結(jié)合后活化，可調(diào)控角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和活化［10］。我們發(fā)現(xiàn)干擾組FGF7 表達(dá)水平上升?；谏鲜鼋Y(jié)果，我們推測NCSTN基因表達(dá)下調(diào)可通過抑制SPRED2表達(dá)，激活Ras-MAPK-ERK介導(dǎo)的受體酪氨酸激酶FGF7-FGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞的異常增殖和分化。

在胰島素-胰島素樣生長因子（IGF）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，IGF 家族由于可調(diào)控角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖、分化、遷移和黏附，參與皮膚腫瘤和銀屑病的發(fā)生發(fā)展［11］。IGF 家族包括IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ兩種生長因子，IGF 結(jié)合蛋白（IGFBP）可調(diào)節(jié)IGF 的活性。IGF-Ⅱ可直接結(jié)合細(xì)胞外基質(zhì)的玻連蛋白，而IGF-Ⅰ卻無法結(jié)合。研究表明IGFBP5可使IGF-Ⅰ易于結(jié)合玻連蛋白，形成IGF-Ⅰ/IGFBP5/玻連蛋白復(fù)合物，從而促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和遷移。本研究中，NCSTN基因表達(dá)下調(diào)可促進(jìn)IGFBP5的表達(dá)，結(jié)合文獻(xiàn)，推測其可能通過增強(qiáng)與IGF-Ⅰ的結(jié)合發(fā)揮作用。

絲氨酸/蘇氨酸激酶ROCK 是小GTP 酶RhoA的下游效應(yīng)分子，包括ROCK1 和ROCK2，在調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞黏附和促進(jìn)其終末分化中發(fā)揮重要作用［12］。激活ROCK2的表達(dá)可誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞分化標(biāo)志的產(chǎn)生［13］；使用ROCK分子的選擇性阻斷劑可完全抑制表皮角質(zhì)形成細(xì)胞分層的形成，說明ROCK 信號(hào)通路的表達(dá)缺失可抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的終末分化［14-15］。因此，NCSTN基因表達(dá)下調(diào)可能通過抑制RhoA/ROCK2信號(hào)通路，抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的分化，促進(jìn)其增殖。

骨形成發(fā)生蛋白BMP6屬于轉(zhuǎn)化生長因子β超家族成員，該家族成員在調(diào)控細(xì)胞增殖和分化中發(fā)揮重要作用。BMP6可促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞早期分化標(biāo)記角蛋白1和10的表達(dá)，促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的分化［16］。Gosselet等［17］也發(fā)現(xiàn)，BMP6可通過抑制表皮干細(xì)胞的增殖，從而阻遏角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其終末分化，這種作用可能有細(xì)胞周期素依賴激酶抑制蛋白P57 的參與。本研究中芯片及實(shí)時(shí)PCR 結(jié)果顯示，沉默NCSTN 基因表達(dá)后可能通過抑制BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響角質(zhì)形成細(xì)胞的正常增殖和分化。

本實(shí)驗(yàn)中篩選出的NCSTN 基因干擾組與陰性對照組的重要差異表達(dá)基因，較多參與角質(zhì)形成細(xì)胞增殖分化相關(guān)信號(hào)通路，提示NCSTN 基因功能缺失性突變可導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞異常的增殖分化。差異基因的生物信息學(xué)分析為我們今后的研究奠定了基礎(chǔ)，后續(xù)我們將挑選感興趣的基因在蛋白水平、原代角質(zhì)形成細(xì)胞和動(dòng)物模型上做深入的研究，并在人AI皮損中進(jìn)行驗(yàn)證。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突