嚴(yán)雙鳳 徐志波

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）及其更嚴(yán)重形式呼吸窘迫綜合征（ARDS）是重癥患者死亡的主要原因[1]，ALI 的發(fā)生可以由許多因素觸發(fā)，例如休克、敗血癥、創(chuàng)傷、燒傷、嚴(yán)重的肺炎和急性胰腺炎等。ALI 的發(fā)病機(jī)制特征是快速起效的肺水腫，低氧血癥，肺泡—毛細(xì)血管屏障損傷，炎性細(xì)胞募集，不受控制的氧化應(yīng)激和炎癥過程[2]。研究表明，脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）誘導(dǎo)的急性炎癥反應(yīng)能明顯促進(jìn)ALI 的發(fā)生和發(fā)展[3]。傳統(tǒng)中藥卷柏具有抗癌、活血、抑菌、解痙的功效。穗花杉雙黃酮是卷柏的乙酸乙酯提取物，此前已有報(bào)道穗花杉雙黃酮具有抗氧化、降血糖、保護(hù)血管、抗炎及抗腫瘤等功效[4-6]。本研究探討穗花杉雙黃酮對LPS 誘導(dǎo)的大鼠ALI 的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng) 物 60 只雄性SD 大鼠（SPF 級），體質(zhì)量（200±10）g，均購自上海吉輝實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證∶SCXK（滬）2017-0012，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理批號∶2018154，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號∶SCXK（浙）2014-0001。實(shí)驗(yàn)期間，動(dòng)物自由進(jìn)食，光照12h。

1.2 細(xì) 胞 人肺上皮細(xì)胞系A(chǔ)549 購自美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心（ATCC）。

1.3 藥 物 穗花杉雙黃酮（批號6284595）購自上海展舒化學(xué)科技有限公司；地塞米松磷酸鈉注射液（批號000706）購自江蘇漣水制藥有限公司；LPS（批號1905073）購自大連美侖生物技術(shù)有限公司。

1.4 試劑及儀器 蘇木精-伊紅染色法（Hematoxylin-Eosin staining，HE）染色試劑盒（批號20160122）購自北京索萊寶科技有限公司；大鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA 檢測試劑盒（批號142073044）、大鼠白細(xì)胞介素-6（IL-6）ELISA 檢測試劑盒（批號141702035）、大鼠白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）ELISA 檢測試劑盒（批號145535023）均購自美國賽默飛世爾；微小RNA 140-5p（miR-140-5p）mimic 及mimic-NC（批號G394885）、microRNA 轉(zhuǎn)染試劑盒（批號9897834）購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；Toll 樣受體4（TLR4）兔單抗（批號T9385）、核因子活化B 細(xì)胞κ 輕鏈增強(qiáng)子（NF-κB）兔單抗（批號943859）購自美國abcam 公司，Actin 鼠單抗（批號52545）購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。奧豪斯電子天平SPX2201ZH 購自奧豪斯儀器（上海）有限公司；Pannoramic 切片掃描儀購自濟(jì)南吉丹爾電子有限公司；PHERAstar FSX 多功能酶標(biāo)儀購自美國Bio-Gene科技有限公司；ChemiDoc MP 掃膜儀、熒光定量PCR儀購自美國伯樂公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 大鼠ALI 模型的構(gòu)建 將60 只SPF 級大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為四組∶對照組、模型組、陽性對照組、穗花杉雙黃酮組（簡稱穗花杉組），每組15 只。造模前12h 大鼠禁食，造模開始先用異戊巴比妥（30mg/kg）腹腔注射麻醉，模型組、陽性對照組和穗花杉組大鼠均通過氣道滴注LPS（3.0mg/kg，100μL），對照組氣道滴注等體積的生理鹽水，6h 后陽性對照組大鼠腹腔注射地塞米松（2.5mg/kg，100μL），穗花杉組大鼠腹腔注射穗花杉雙黃酮（2.5mg/kg，100μL），對照組和模型組注射等體積生理鹽水，24h后出模。

2.2 大鼠肺組織石蠟切片HE 染色 大鼠肺組織取材后，利用10%多聚甲醛固定，經(jīng)過脫水浸蠟包埋后制成石蠟切片，切片厚度為0.4μm。按照HE 染色試劑盒說明書操作進(jìn)行染色，最后利用中性樹脂分片，使用切片掃描儀掃描切片，選取HE 染色肺組織特征性區(qū)域展示。

2.3 ELISA 法檢測大鼠血清TNF-α、IL-6 和IL-1β水平 分離出各組大鼠血清后，按照ELISA 檢測試劑盒檢測血清TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平。每只大鼠血清樣3 個(gè)復(fù)孔，使用多功能酶標(biāo)儀測定450nm出吸光度值，每只大鼠3 個(gè)復(fù)孔取平均值。

2.4 WB 檢測大鼠肺組織TLR4、NF-κB 蛋白水平肺組織部分剪碎后加入蛋白裂解液，利用組織勻漿儀制備組織勻漿，放冰上裂解1h 后，離心取上清為蛋白樣，利用BCA 法測定蛋白濃度后，加入loading使蛋白樣終濃度為1μg/μL，蛋白跑膠上樣20μg，經(jīng)過電泳轉(zhuǎn)膜封閉后，4℃孵育一抗過夜，洗去一抗后室溫孵育化學(xué)發(fā)光二抗1h，使用ChemiDoc MP 掃膜儀分析結(jié)果。

2.5 細(xì)胞培養(yǎng) 人肺上皮細(xì)胞A549 采用含10%胎牛血清的高糖1640 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)（含1%的青霉素-鏈霉素雙抗）于37℃恒溫培養(yǎng)箱中。細(xì)胞密度達(dá)到90%～95%時(shí)傳代鋪板。將肺上皮細(xì)胞系A(chǔ)549 鋪板于6 孔板中，分四組∶刺激組、陽性對照組和穗花杉組加入100ng/mL 的LPS，同時(shí)陽性對照組加入地塞米松（100ng/mL），穗花杉組加入穗花杉雙黃酮100ng/mL，對照組加入等體積生理鹽水，處理4h 后提取RNA。對于miR-140-5p mimic 和mimic-NC 轉(zhuǎn)染A549，按照吉瑪基因microRNA 轉(zhuǎn)染試劑盒說明書操作。轉(zhuǎn)染24h 后，同樣分為四組∶刺激組、miR-140-5p mimic 組、mimic-NC 組分別加入100ng/mL的LPS，對照組加入等體積生理鹽水，刺激4h 后提取RNA。

2.6 RT-PCR 檢測miR-140-5p、TLR4、NF-κB 表達(dá)將組織或者細(xì)胞RNA 提取后，逆轉(zhuǎn)為cDNA 進(jìn)行RT-PCR 檢測，引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。引物如下∶miR-140-5p 引物∶forward 5-′TGCGGCAGTGGTTTTACCCTATG-3′，reverse 5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′；TLR4 引 物∶forward 5-′CCTCGGCGGCAACTTCATAA-3′，reverse 5′-AGAGCGGATCTGGTTGTACTG-3′；NF-κB p65 引物∶forward 5-′ATCCCATCTTTGACAATCGTGC-3′，reverse 5′-5′-CTGGTCCCGTGAAATACACCTC-3′。反應(yīng)程序∶94℃變性20s，60℃退火30s，72℃延伸30s，循環(huán)數(shù)35 個(gè)。3 次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用GraphPad Prism 5 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（），多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組大鼠肺組織濕/干重比 與對照組比較，模型組大鼠肺組織濕/干重比明顯增加（P＜0.05），提示模型構(gòu)建成功。與模型組比較，穗花杉組、地塞米松處理陽性對照組大鼠肺組織濕/干重比明顯降低（P＜0.05），穗花杉組與陽性對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

3.2 各組大鼠肺組織病理形態(tài) 對照組大鼠肺泡組織結(jié)構(gòu)完整，無炎癥浸潤情況；模型組ALI 大鼠出現(xiàn)明顯的炎性浸潤，肺泡間隔增厚和間質(zhì)水腫；與模型組ALI 大鼠比較，地塞米松處理陽性對照組ALI 大鼠肺部炎癥明顯減輕，肺泡間隔變薄；穗花杉組肺組織炎癥細(xì)胞明顯減少，肺泡間隔明顯變薄。見插頁圖1。

表1 各組大鼠肺組織濕/干重比比較（）

表1 各組大鼠肺組織濕/干重比比較（）

注∶對照組給予生理鹽水氣道滴注+生理鹽水腹腔注射；模型組給予LPS（3.0mg/kg，100μL）氣道滴注+生理鹽水腹腔注射；陽性對照組給予LPS（3.0mg/kg，100μL）氣道滴注+地塞米松（2.5mg/kg，100μL）腹腔注射；穗花杉組給予LPS（3.0mg/kg，100μL）氣道滴注+穗花杉雙黃酮（2.5mg/kg，100μL）腹腔注射；LPS 為脂多糖；與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

3.3 各組大鼠血清TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平 與對照組比較，模型組ALI 大鼠血清TNF-α、IL-6 和IL-1β 表達(dá)水平明顯升高（P 均＜0.05）；與模型組比較，穗花杉組和陽性對照組大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β 表達(dá)水平明顯降低（P 均＜0.05），穗花杉組與陽性對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平比較（pg/mg，）

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平比較（pg/mg，）

注∶對照組給予生理鹽水氣道滴注+生理鹽水腹腔注射；模型組給予LPS（3.0mg/kg，100μL）氣道滴注+生理鹽水腹腔注射；陽性對照組給予LPS（3.0mg/kg，100μL）氣道滴注+地塞米松（2.5mg/kg，100μL）腹腔注射；穗花杉組給予LPS（3.0mg/kg，100μL）氣道滴注+穗花杉雙黃酮（2.5mg/kg，100μL）腹腔注射；LPS 為脂多糖；TNF-α 為腫瘤壞死因子-α；IL-6 為白細(xì)胞介素-6；IL-1β 為白細(xì)胞介素-1β；與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

3.4 各組大鼠肺組織TLR4、NF-κB 蛋白表達(dá)水平模型組大鼠肺組織TLR4、NF-κB 蛋白水平明顯高于對照組；穗花杉組和陽性對照組ALI 模型大鼠肺組織TLR4、NF-κB 明顯低于模型組。穗花杉組與陽性對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見插頁圖2。

3.5 各組大鼠肺組織miR-140-5p 相對表達(dá)量 與對照組比較，模型組大鼠肺組織miR-140-5p 表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.05）；與模型組比較，穗花杉組、陽性對照組大鼠肺組織miR-140-5p 表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05），穗花杉組與陽性對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

3.6 miR-140-5p 對人肺上皮細(xì)胞TLR4、NF-κB 表達(dá)的影響 與對照組比較，刺激組人肺上皮細(xì)胞miR-140-5p 表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.05）；與刺激組比較，穗花杉組人肺上皮細(xì)胞miR-140-5p 表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05）。穗花杉組與陽性對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與對照組比較，刺激組人肺上皮細(xì)胞TLR4、NF-κB 表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05）；與刺激組比較，miR-140-5p mimic 組TLR4、NF-κB 表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.05）。見表4-5。

表3 各組大鼠肺組織miR-140-5p 相對表達(dá)量比較（）

表3 各組大鼠肺組織miR-140-5p 相對表達(dá)量比較（）

注∶對照組給予生理鹽水氣道滴注+生理鹽水腹腔注射；模型組給予LPS（3.0mg/kg，100μL）氣道滴注+生理鹽水腹腔注射；陽性對照組給予LPS（3.0mg/kg，100μL）氣道滴注+地塞米松（2.5mg/kg）腹腔注射；穗花杉組給予LPS（3.0mg/kg，100μL）氣道滴注+穗花杉雙黃酮（2.5mg/kg）腹腔注射；LPS 為脂多糖；與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

表4 各組人肺上皮細(xì)胞miR-140-5p 相對表達(dá)量比較（）

表4 各組人肺上皮細(xì)胞miR-140-5p 相對表達(dá)量比較（）

注∶對照組給予生理鹽水刺激4h；刺激組給予LPS（100ng/mL）刺激4h；陽性對照組給予LPS（100ng/mL）+地塞米松（100ng/mL）刺激4h；穗花杉組給予LPS（100ng/mL）+穗花杉雙黃酮（100ng/mL）刺激4h；LPS 為脂多糖；與對照組比較，aP＜0.05；與刺激組比較，bP＜0.05

表5 各組人肺上皮細(xì)胞TLR4、NF-κB 相對表達(dá)量比較（）

表5 各組人肺上皮細(xì)胞TLR4、NF-κB 相對表達(dá)量比較（）

注∶對照組給予生理鹽水刺激4h；刺激組給予LPS（100ng/mL）刺激4h；miR-140-5p mimic 組給予預(yù)轉(zhuǎn)染miR-140-5p mimic 24h+LPS（100ng/mL）刺激4h；mimic-NC 組給予預(yù)轉(zhuǎn)染mimic-NC 24h+LPS（100ng/mL）刺激4h；TLR4 為Toll 樣受體4；NF-κB 為核因子活化B細(xì)胞κ 輕鏈增強(qiáng)子；LPS 為脂多糖；與對照組比較，aP＜0.05；與刺激組比較，bP＜0.05

4 討論

穗花杉雙黃酮是深綠卷柏的乙酸乙酯提取物，此前多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，穗花杉雙黃酮的抗腫瘤活性，能夠有效抑制腫瘤生長、促進(jìn)細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移[7]。而其抗炎活性報(bào)道較少，Pan 等[8]發(fā)現(xiàn)穗花杉雙黃酮通過抑制ERK 信號活化，從而抑制NF-κB 的活化。本研究也發(fā)現(xiàn)，穗花杉雙黃酮能夠抑制TLR4/NF-κB 信號，從而抑制ALI 炎癥反應(yīng)。

LPS 進(jìn)入肺部組織后與其主要受體TLR4 結(jié)合，促進(jìn)NF-κB 介導(dǎo)的炎癥基因的表達(dá)，如TNF-α、IL-6 和IL-1β 等[9-10]。Wang 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，抑制TLR4/NF-κB 能夠顯著減輕LPS 誘導(dǎo)的大鼠ALI 癥狀?；诖?，本研究對大鼠ALI 肺組織內(nèi)TNF-α、IL-6 和IL-1β 炎癥因子表達(dá)及TLR4、NF-κB 蛋白進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)穗花杉雙黃酮能明顯抑制TNF-α、IL-6 和IL-1β 等炎癥因子的表達(dá)（P＜0.05），同時(shí)WB 結(jié)果顯示，穗花杉雙黃酮明顯抑制TLR4、NF-κB 蛋白水平。

文獻(xiàn)報(bào)道，microRNA 在肺部炎癥中參與藥物治療的過程[12-13]，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-140-5p 通過靶向TLR4/NF-κB 參與調(diào)控LPS 誘導(dǎo)小鼠ALI 的肺部炎癥的發(fā)生[14]。因此推測穗花杉雙黃酮是否通過miR-140-5p 影響TLR4/NF-κB 的表達(dá)，從而緩解肺部急性炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，穗花杉雙黃酮組大鼠肺部miR-140-5p mimic 表達(dá)明顯高于模型組（P＜0.05），同時(shí)RT-PCR 結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-140-5p mimic 能明顯抑制LPS 誘導(dǎo)的TLR4/NF-κB 表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）。因此穗花杉雙黃酮可能通過抑制LPS作用下miR-140-5p mimic 下調(diào)，從而降低TLR4/NF-κB 的表達(dá)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)穗花杉雙黃酮能夠促進(jìn)miR-140-5p mimic 表達(dá)，抑制ALI 炎癥過程中關(guān)鍵蛋白TLR4/NF-κB 表達(dá)以及其下游炎癥因子TNFα、IL-6 和IL-1β 的生成，明顯減輕LPS 誘導(dǎo)的大鼠ALI。