賈文婷 楊慧 吳洪斌
摘要:環(huán)磷酸腺苷(cAMP)是機(jī)體內(nèi)一種重要的生理活性物質(zhì),能調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞的多種功能活動(dòng),開(kāi)發(fā)利用前景廣闊。以新疆地區(qū)紅棗為原料,采用超微粉碎法和真空冷凍干燥法對(duì)紅棗進(jìn)行預(yù)處理,通過(guò)響應(yīng)面法建立了水浴提取環(huán)磷酸腺苷的二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型,優(yōu)化提取工藝參數(shù),通過(guò)比較2種不同的預(yù)處理方式,得到的結(jié)果如下:超微粉碎法處理后cAMP提取率為318.31 μg/g,真空冷凍干燥處理后cAMP提取率為239.35 μg/g。
關(guān)鍵詞:新疆紅棗;環(huán)磷酸腺苷;提取;超微粉碎法;真空冷凍干燥法;響應(yīng)面分析
環(huán)磷腺苷(cAMP)是細(xì)胞內(nèi)的重要物質(zhì),參與調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝,是生命信息傳遞的“第二信使”[1-2]。它在動(dòng)物體內(nèi)可以增強(qiáng)心肌細(xì)胞抗損傷、抗缺血和缺氧能力,是動(dòng)物體內(nèi)一種廣泛存在的、具有生理活性的重要物質(zhì)[3-5]。目前,紅棗中cAMP的含量是已知植物中最高的,隨著紅棗深加工及副產(chǎn)物綜合利用產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展以及醫(yī)療和保健行業(yè)對(duì)cAMP需求量的增大,使用不同方法從紅棗中提取cAMP的研究越來(lái)越多,因此,深入研究如何高效、低耗、環(huán)保地從紅棗中提取cAMP具有重要意義[6]。
本研究以新疆地區(qū)紅棗為原料,采用超微粉碎法、真空冷凍干燥法2種不同方式進(jìn)行預(yù)處理,水浴法提取cAMP,通過(guò)單因素及響應(yīng)面試驗(yàn),利用 Design-Expert中BBD統(tǒng)計(jì)軟件,以紅棗cAMP提取率為響應(yīng)值,獲得2種預(yù)處理方式的最佳工藝,并通過(guò)高效液相色譜法測(cè)定其提取率,以期為提高cAMP提取率提供參考依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 材料
紅棗,購(gòu)自新疆石河子市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。
1.2 儀器與試劑
1.2.1 儀器 超微粉碎機(jī)、真空冷凍干燥機(jī)、烘箱、高效液相色譜儀、電子天平、臺(tái)式低速離心機(jī)、數(shù)顯恒溫水浴鍋、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。
1.2.2 試劑 cAMP標(biāo)準(zhǔn)品(純度>99%)、甲醇(色譜純)、磷酸二氫鉀(優(yōu)級(jí)醇)、果膠酶、纖維素酶。
1.3 方法
1.3.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取cAMP標(biāo)準(zhǔn)品,加適量蒸餾水制成15 μg/mL的溶液,搖勻,經(jīng) 0.45 μm 的濾膜過(guò)濾即得對(duì)照品溶液[7]。
1.3.2 樣品的制備 精密稱取采用不同預(yù)處理方式處理后的棗粉10.00 g,加入440 mL超純水,于90 ℃下水浴提取2次,每次1 h,合并提取液,于離心機(jī)中3 000 r/min離心15 min,取上清液減壓濃縮至100 mL,過(guò)0.45 μm微孔濾膜[8],得樣品溶液。
1.3.3 色譜條件 ZORBAX SB-Aq C18色譜柱(3.5 μm,4.6 mm×150 mm),柱溫為30 ℃,以 V水 ∶ V乙腈=40 ∶ 60)為流動(dòng)相,流速為0.6 mL/min,進(jìn)樣量為5 μL。
1.3.4 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源(ESI),正離子檢測(cè),霧化氣(N2)壓力設(shè)為0.28 MPa;干燥氣(N2)的流速設(shè)為10 L/min,干燥氣(N2)的溫度設(shè)為350 ℃。多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式監(jiān)測(cè)反應(yīng)質(zhì)荷比(m/z)為330.10~136.00。碎裂電壓為140 V;碰撞能量為25 V。
1.3.5 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 取“1.3.1”節(jié)中配制的cAMP對(duì)照溶液,加超純水配制成1.00 mg/mL的混合儲(chǔ)備液,于4 ℃保存;使用時(shí)用超純水稀釋,配制成cAMP質(zhì)量濃度為0.01、1、10、50、100、500、1 000 ng/mL 的混合對(duì)照品溶液[9]。標(biāo)樣圖譜如圖1所示。
2 結(jié)果與分析
2.1 超微粉碎法最佳工藝
2.1.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果 影響紅棗超微粉碎的主要參數(shù)有物料水分含量(%)、單次打粉時(shí)間(s)、打粉次數(shù)(次)。分別對(duì)這幾個(gè)參數(shù)進(jìn)行單因素試驗(yàn),(1)在單次打粉時(shí)間為10 s、打粉次數(shù)為5次的條件下,分別測(cè)定物料含水量為6%、8%、10%、12%、14%時(shí)的cAMP提取率;(2)在物料含水量為10%、打粉次數(shù)為5次的條件下,分別測(cè)定單次打粉時(shí)間為8、10、12、14、16 s時(shí)的cAMP提取率;(3)在物料含水量為10%、單次打粉時(shí)間為10 s的條件下,分別測(cè)定打粉次數(shù)為1、3、5、7、9次時(shí)的cAMP提取率。從表1可以看出,cAMP提取率隨物料含水量的增加先增大后減小,在物料含水量為10%時(shí)達(dá)到最大值;cAMP提取率隨單次打粉時(shí)間的增加先增大后減小,在單次打粉時(shí)間為10 s時(shí)達(dá)到最大值;cAMP提取率隨打粉次數(shù)的增加先增大后減小,在打粉次數(shù)為5次時(shí)達(dá)到最大值。因此,選擇物料含水量為8%、10%、12%,單次打粉時(shí)間為5、10、15 s,打粉次數(shù)3、5、7次進(jìn)行響應(yīng)面分析。
2.1.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果 根據(jù)前期單因素試驗(yàn)的結(jié)果,選取物料水分含量(A)、單次打粉時(shí)間(B)、打粉次數(shù)(C)作為自變量,產(chǎn)品的cAMP提取率(Y1)作為因變量,進(jìn)行二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn),各因子的水平設(shè)置及編碼值見(jiàn)表2。
利用Design-Expert軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案,試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3。
2.1.3 響應(yīng)面結(jié)果分析 應(yīng)用Design-Expert 7.0.0 軟件進(jìn)行多元回歸擬合,得到的模擬回歸方程為:
響應(yīng)面的回歸顯著性方差分析結(jié)果見(jiàn)表4,可以看出,該回歸模型具有極顯著性(P<0.000 1),失擬項(xiàng)(P=0.100 2>0.05)不顯著,相關(guān)系數(shù)R2=0.989 5,大于0.9,說(shuō)明模型相關(guān)度較好[10]。分別以物料水分含量、單次打粉時(shí)間、打粉次數(shù)作響應(yīng)面與等高線分析,由圖2至圖4可知,打粉次數(shù)(C)對(duì)環(huán)磷酸腺苷提取率的影響較大,表現(xiàn)為對(duì)應(yīng)曲線較陡;物料水分含量(A)和單次打粉時(shí)間(B)對(duì)應(yīng)曲線較平緩,表明它們對(duì)環(huán)磷酸腺苷的提取效果影響較小,這與回歸分析的結(jié)果(表4)相吻合。