杜周和 嚴(yán)旭 左艷春

摘要：通過(guò)花粉管通道將高丹草總DNA導(dǎo)入玉米自交系，獲得遺傳改變的突變體。突變體第1代穗柄明顯增長(zhǎng)，結(jié)實(shí)雙穗，第2代長(zhǎng)穗柄性狀消失，雙穗性狀保持，第3代雙穗性狀保持，株高發(fā)生分化。經(jīng)純化選擇，獲得遺傳穩(wěn)定的飼草玉米種質(zhì)新材料，株高增高，葉片變細(xì)長(zhǎng)，雙穗發(fā)育良好，飼用品質(zhì)改善，全株干物質(zhì)含量提高。

關(guān)鍵詞：花粉管通道技術(shù);高丹草;總DNA提取;飼草玉米;種質(zhì)資源

草牧業(yè)是農(nóng)業(yè)的重要組成部分，是一個(gè)國(guó)家農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化水平的重要標(biāo)志。歐美發(fā)達(dá)國(guó)家畜牧產(chǎn)值的60%以上由飼草轉(zhuǎn)化而來(lái)，美國(guó)飼料蛋白的50%以上來(lái)自飼草[1]。任繼周院士指出，制約我國(guó)草業(yè)發(fā)展的瓶頸是品種問(wèn)題。優(yōu)良種質(zhì)資源匱乏是制約我國(guó)飼草品種選育的重要因素之一。草料是草食牲畜的必需飼料組分，過(guò)量使用糧食飼養(yǎng)，不僅增加草食牲畜的養(yǎng)殖成本，而且會(huì)造成草食牲畜免疫力降低，增加發(fā)病機(jī)會(huì)。玉米是重要的糧食和飼料作物，2015年中央一號(hào)文件提出“糧改飼”工程，青貯玉米是工程推薦的首選草種。

利用花粉管通道轉(zhuǎn)導(dǎo)外源DNA是我國(guó)科學(xué)家首創(chuàng)的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)，1981年首次利用該技術(shù)培育出抗枯萎病的棉花新品種[2]。隨后，眾多科學(xué)家以不同植物為對(duì)象進(jìn)行了大量研究，取得一批重要成果[3]。祁永紅等將大豆DNA導(dǎo)入玉米自交系，獲得具有廣泛變異的不同類型[4]。張秀君等將含高賴氨酸蛋白質(zhì)基因的cDNA導(dǎo)入玉米，使籽粒干物質(zhì)中賴氨酸含量提高18.75%[5]。孫學(xué)輝等將高賴氨酸基因?qū)胗衩鬃越幌?，獲得種子中粗蛋白含量11.05%、賴氨酸含量提高16.00%的轉(zhuǎn)化植株[6]。王豐等將稗草總DNA和玉米總DNA導(dǎo)入水稻，獲得抗稻瘟病轉(zhuǎn)化植株[7]。王罡等將Bt抗蟲(chóng)毒蛋白基因轉(zhuǎn)導(dǎo)到玉米自交系，獲得玉米抗蟲(chóng)育種優(yōu)良抗源[8]。曹陽(yáng)等研究獲得抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因高粱[9]。侯文勝等成功將人工合成的雪花蓮凝聚素基因sgna導(dǎo)入優(yōu)良小麥品系[10]。樂(lè)錦華等將廣譜抗真菌的菜豆基因與煙草基因?qū)朊藁ㄓ煽箍菸?、耐黃萎病的抗病新品系[11]。張茂銀等將新疆大賴草DNA導(dǎo)入普通春小麥獲得大穗、多粒、晚熟變異株[12]。鄒冬生等將玉米DNA導(dǎo)入水稻，獲得單穗總粒數(shù)、千粒質(zhì)量顯著增加的超質(zhì)量類型[13]。李建粵等將大豆總DNA導(dǎo)入水稻，提高了稻米的蛋白質(zhì)含量和總氨基酸、賴氨酸含量[14]。

本研究采用花粉管通道技術(shù)將植株分蘗力強(qiáng)、產(chǎn)草量高的樂(lè)食高丹草總DNA導(dǎo)入玉米自交系，以期獲得在營(yíng)養(yǎng)體生物產(chǎn)量、品質(zhì)、抗性、再生性等方面有所突破的飼草玉米新種質(zhì)，豐富飼草玉米育種的親本選擇。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)草種為樂(lè)食高丹草，市售;自46玉米自交系由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院牧業(yè)研究中心提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)地概況 試驗(yàn)地位于四川省南充市順慶區(qū)瀠溪鎮(zhèn)（106°12′E，31°06′N），海拔高度為 305 m，年日照時(shí)數(shù)為1 062 h;年均氣溫為17.6 ℃，極端最低溫度為-2.8 ℃，極端最高溫度為 42.1 ℃，10 ℃以上年積溫為5 206.9 ℃，平均氣溫10 ℃以上的天數(shù)為232 d;無(wú)霜期為307 d;年降水量為1 060 mm。紫色土壤，0～20 cm耕作層土壤pH值為7.94，有機(jī)質(zhì)含量為42.8 g/kg，含全氮 5.1 g/kg、硝態(tài)氮178.82 mg/kg、速效鉀 163.66 mg/kg、有效磷 11.96 mg/kg。

1.2.2 植物基因組DNA提取 樂(lè)食高丹草種子用培養(yǎng)箱25 ℃催芽，剪取幼苗幼嫩莖葉，用天根生化科技（北京）有限公司的DP305型試劑盒提取基因組總DNA;核酸測(cè)定儀NanoDrop 2000測(cè)定濃度，內(nèi)切酶Hind Ⅲ、BamHⅠ20 ℃酶解8 h，用檸檬酸鈉（SSC）緩沖液稀釋至300 μg/mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 外源DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)入玉米自交系 2014年4月9日，田間種植自46玉米自交系，穴播，行距 100 cm、株距40 cm，苗高15 cm時(shí)間苗，每穴留壯苗1株。開(kāi)花前夕用硫酸紙袋分別套住雌花和雄花，避免田間自然傳粉污染。每天觀察開(kāi)花進(jìn)度，雌花盛開(kāi)時(shí)人工收集花粉自交授粉，然后繼續(xù)套袋保護(hù)。人工授粉15～24 h后，剪去距穗軸頂部1～2 cm 以上的苞葉和花絲，用移液器將樂(lè)食高丹草DNA溶液滴在花絲剪口處，每穗300 μL。繼續(xù)套袋保護(hù)直至玉米成熟，單穗收種。

1.2.4 種植調(diào)查 轉(zhuǎn)基因處理玉米單穗收種，翌年按穗行播種，同時(shí)播種未處理的自46自交系作對(duì)照，全生育期觀察比較生長(zhǎng)發(fā)育情況，發(fā)掘性狀變異株。變異后代隔離種植，調(diào)查其生物學(xué)性狀、農(nóng)藝學(xué)性狀及遺傳分化情況。轉(zhuǎn)化第1代只發(fā)現(xiàn)1株變異株，作單株調(diào)查;其他各代均分別測(cè)定5個(gè)單株計(jì)算算術(shù)平均值。葉長(zhǎng)、葉寬測(cè)量自上而下第7張葉;株高、葉長(zhǎng)、葉寬、穗位、穗長(zhǎng)、穗圍粗用卷尺測(cè)量;莖粗用游標(biāo)卡尺在基部第2莖節(jié)“十”字方向測(cè)量2次;全株干物質(zhì)含量測(cè)定在籽粒1/2乳線期收割（留茬高度為5 cm），105 ℃殺青30 min后65 ℃烘干測(cè)定。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 采用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樂(lè)食高丹草基因組DNA提取

經(jīng)檢測(cè)，所提取的DNA D260 nm/D280 nm值為 1.83，滿足試驗(yàn)要求。

2.2 變異材料發(fā)掘

經(jīng)種植觀察，處理材料第1代和對(duì)照在種子出苗率、生長(zhǎng)發(fā)育速度、株高、莖粗、株型、葉片大小、葉色、穗位等指標(biāo)均未發(fā)現(xiàn)明顯變異。在處理材料的08穗行發(fā)現(xiàn)1株變異（命名為46優(yōu)），單株結(jié)實(shí)雙穗，穗柄明顯增長(zhǎng)，穗柄長(zhǎng)26 cm（圖1）;籽粒變大，百粒質(zhì)量增加，約為38 g，與對(duì)照相比增加約33.33%（表1）。

2.3 變異材料繼代

3.4 研究成果的實(shí)踐意義

本研究采用花粉管通道技術(shù)，突破種屬限制，將同科異屬的高丹草DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)入玉米自交系中，獲得了株高增高、葉形變得細(xì)長(zhǎng)、雙穗性狀突出、干物質(zhì)含量提高的飼草玉米新種質(zhì)，增加了飼草玉米育種的素材選擇。植株形態(tài)的改變表明的確有外源基因整合到受體基因組中，引發(fā)了可穩(wěn)定遺傳的變異;雙穗發(fā)育良好，增加了玉米籽粒在收獲物種的比例，飼用品質(zhì)提高。但研究還只是初步的，新材料的生理生化變異及轉(zhuǎn)化基因的分子檢測(cè)尚待深入進(jìn)行，新材料的育種價(jià)值更需試驗(yàn)驗(yàn)證。本研究的重要實(shí)踐意義不在于獲得了1份突變新材料，更在于將花粉管通道轉(zhuǎn)基因技術(shù)引入飼草育種研究中，為飼草種質(zhì)資源創(chuàng)新增添了一條行之有效的新途徑。

3.5 結(jié)論

飼草核心骨干種質(zhì)資源匱乏及優(yōu)良品種不足嚴(yán)重制約我國(guó)畜牧業(yè)的發(fā)展。對(duì)廣大一線育種工作者而言，花粉管通道轉(zhuǎn)基因技術(shù)是創(chuàng)新種質(zhì)資源的一種有效手段，已在其他作物育種中廣泛應(yīng)用，取得可喜成績(jī)，但在飼草育種上幾乎還是空白。本研究成功將高丹草DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)到飼草玉米中，獲得有益突變新材料，展現(xiàn)了花粉管通道轉(zhuǎn)基因技術(shù)在飼草種質(zhì)資源創(chuàng)新中的可行性，為創(chuàng)制出量多質(zhì)優(yōu)的飼草種質(zhì)新資源提供參考。

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