藺 萌 王亞婷 胡 軍 苗義艷 雷寧靜

（鄭州大學基礎醫(yī)學院 河南·鄭州 450001）

醫(yī)學微生物學實驗是基礎醫(yī)學教育中的一門重要實驗課程，是醫(yī)學各專業(yè)的必修課程，要求醫(yī)學生掌握無菌操作和實踐培養(yǎng)。[1]在實驗教學過程中，細菌的特殊結構教學觀察主要是示教標本觀察。芽孢和鞭毛屬于細菌的特殊結構，標本制備可選用的菌種很多，本實驗室主要使用的是破傷風梭菌。破傷風梭菌屬于革蘭氏染色陽性厭氧菌，能形成芽孢，有鞭毛，主要分布于土壤、人和動物的腸道，是一種歷史悠久的梭狀芽胞桿菌。[2-3]本文主要對本實驗室的芽孢和鞭毛標本制備過程進行總結，探討其它符合實驗教學要求的菌種來源，并討論這種標本制備方法是否能作為一項新的實驗內容應用到實驗教學過程中。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）破傷風梭菌菌種，地表10cm 以下土壤；營養(yǎng)瓊脂等。（2）95%乙醇，石碳酸復紅液，堿性美藍染液，飽和鉀明礬染液，堿性復紅乙醇飽和液等。（3）厭氧培養(yǎng)箱，無菌操作臺等。

1.2 方法

（1）菌種培養(yǎng)。復蘇破傷風梭菌菌種，取菌液進行三區(qū)劃線，厭氧培養(yǎng)24h，作為1 代，再選取平板中個體較大、中心密邊緣疏松的菌落，再次三區(qū)劃線培養(yǎng)24h，作為2 代，以此類推，傳代3 代以上增強細菌的活力。

（2）土壤中分離菌種。隨機取地表10cm 以下土壤5-10g，加入300mL生理鹽水，煮沸20min，冷卻至室溫，取上清液三區(qū)劃線，37℃厭氧培養(yǎng)72h，選取平板中個體較大、中心密邊緣疏松的單菌落，革蘭染色鑒定確認為陽性菌，菌體芽孢呈鼓槌狀，位于菌體一端，為破傷風梭菌。菌落接種于肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h 增菌。傳代至5-7 代以增強細菌的活力。

（3）芽孢染色。在載玻片中央滴加1 滴蒸餾水（約50 L），挑取傳菌3 代培養(yǎng)≥72h 的單菌落，按常規(guī)方法進行涂片、干燥、固定，加石碳酸復紅液，持續(xù)5min 微火加熱并隨時滴加染液，水洗，95%乙醇脫色至脫不下紅色為止準，水洗，滴加堿性美藍染液染色1min，濾紙吸干，顯微鏡下觀察到芽孢結構。[4]

（4）鞭毛染色。提前將飽和鉀明礬染液200mL、5%石碳酸50mL、20%鞣酸液20mL 混合，加入堿性復紅乙醇飽和液10mL，混合后濾紙過濾（染色前再次過濾）。在載玻片中心靠一端的位置滴加2 滴蒸餾水（約100 L），挑取傳菌≥7 代培養(yǎng)16h 的單菌落，37℃靜置5min 使玻片始終處于濕潤狀態(tài)，傾斜玻片使液體從另一端緩慢流下，用濾紙吸去多余菌液，室溫干燥，滴加染液染色5min，水洗，濾紙吸干，顯微鏡下觀察到鞭毛結構。[5]

（5）高壓滅菌處理。所用土壤、菌液、平板、濾紙等物品在標本制備完成后均經(jīng)過高壓滅菌處理。

2 結果

2.1 兩種來源的破傷風梭菌芽孢染色標本

由保存菌種制備的芽孢標本中，芽胞呈圓形，芽孢位于菌體的一端，直徑比菌體粗，使菌體呈鼓槌狀（圖1-A）；由土壤中分離的菌種制備的芽孢標本中，菌體呈鼓槌狀，芽胞呈圓形位于菌體的一端，與保存菌種制備的芽孢標本形態(tài)特征相同（圖1-B）。

圖1 兩種來源的破傷風梭菌芽孢染色(×1000)

2.2 兩種來源的破傷風梭菌鞭毛染色標本

由保存菌種制備的鞭毛標本中，鞭毛分布于菌體四周（圖2-A）；由土壤中分離的菌種制備的鞭毛標本中，鞭毛同樣分布于菌體四周，與保存菌種制備的鞭毛標本形態(tài)特征相似（圖2-B）。

圖2 兩種來源的破傷風梭菌鞭毛染色(×400)

3 討論

破傷風梭菌屬于厭氧性細菌中的厭氧芽孢梭菌屬，是破傷風的病原菌，在窄而深的傷口、有異物污染、大面積創(chuàng)傷、燒傷或同時有其它需氧菌或兼性厭氧菌混合感染，均易造成厭氧環(huán)境，導致菌體侵入人體，發(fā)芽繁殖而致病，是破傷風梭菌感染的重要條件。[6]除創(chuàng)傷感染外，分娩時斷臍不潔，手術器械滅菌不嚴等，均可引起發(fā)病。[7-8]

醫(yī)學微生物學實驗教學中，對破傷風梭菌的觀察一般是觀察芽孢形態(tài)，因其周身有鞭毛，也可作為鞭毛標本觀察的菌種。破傷風梭菌的芽孢呈鼓槌裝，鞭毛分布于菌體四周。芽孢和鞭毛標本制備是一項常規(guī)的實驗技術。[9-10]本實驗室所用的菌種主要是破傷風梭菌菌種。破傷風梭菌營養(yǎng)要求不高，在瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)24-48h，可形成不規(guī)則的菌落，中心密周邊疏，直徑1mm 以上。[11]為了增加實驗操作的趣味性和可操作性，本文對比了已保存菌種和土壤中分離的破傷風梭菌制備的芽孢和鞭毛標本，結果顯示兩種來源的菌種制備出來的標本形態(tài)結構相同，具有破傷風梭菌芽孢和鞭毛的特征性，因此，從土壤中分離破傷風梭菌可以作為一種新的菌種來源應用到實驗教學標本制備過程中。實驗材料來源于土壤，容易獲取，操作容易，可重復性高，在制備的芽孢和鞭毛標本中，菌體形態(tài)完整，芽孢特征明顯，鞭毛排列相對整齊，顏色對比度大，實驗教學過程中便于觀察。同時，可以結合實驗教學內容，選擇土壤中不同菌種進行分離純化，增加實驗的多樣性。也可分析土壤中不同種類芽孢的數(shù)量比例，觀察不同芽孢結構，分析土壤中可能存在的菌種種類，結合當?shù)丨h(huán)境條件分析土壤中菌種對環(huán)境的影響等。

總之，微生物學是一門實踐性很強的學科，實驗課程在微生物學教學中發(fā)揮了非常重要的作用。為了培養(yǎng)學生的動手能力，應不斷改進醫(yī)學微生物學實驗教學內容和方法。而本實驗室采用從土壤中分離破傷風梭菌并制備芽孢和鞭毛標本的實驗方法既可以增加標本制備的菌種來源，也可以作為一項新的實驗設計內容應用到實驗教學中。